通络方剂对糖尿病大鼠肾脏p38mapk-fn通路的影响-effect of tongluo prescription on renal p 38 mapk - fn pathway in diabetic rats.docxVIP

通络方剂对糖尿病大鼠肾脏 通络方剂对糖尿病大鼠肾脏 P38MAPK-FN 通路的影响 第二军医大学硕士学位论文 第二军医大学硕士学位论文 - - PAGE 1 - - - PAGE 2 - 摘 要 糖尿病肾病是糖尿病重要的微血管并发症之一，它在病理结构上主要以系膜增 生，基底膜增厚为特点，最终出现肾小球硬化、间质纤维化。P38 是 MAPK 家族的成 员之一，在糖尿病肾病的发生、发展中起了重要作用，它参与细胞外基质纤维化等诸 多生理病理过程。通络方剂(Tong luo Recipe,TLR) 是根据中医络病学理论研制而成 的复方制剂，由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫和赤芍等药物组成，本课题组前期 研究表明，其对糖尿病肾病具有保护作用，在糖尿病大鼠肾脏中，可以通过抑制 RAS 系统、抗氧化、改善血管内皮细胞功能等机制发挥作用。然而，通络方剂对糖尿病肾 脏纤维连接蛋白（FN）的影响，目前尚无相关报道。本实验使用链脲佐菌素（STZ） 诱导糖尿病大鼠模型，观察 TLR 对糖尿病大鼠肾脏 P38MAPK-FN 通路相关蛋白及其病 理结构的影响，进一步探讨 TLR 对糖尿病肾脏保护作用的可能机制。 本研究通过自动化生化分析仪检测正常对照组、糖尿病组、通络方剂干预组大鼠 血糖、血尿素氮、血肌酐、左肾重/体重、24 小时尿蛋白、尿蛋白/肌酐比；肾皮质 PAS 染色；电镜观察肾小球基底膜；蛋白质印迹分析检测 t-p38MAPK，p-p38MAPK， t-CREB(环腺苷酸反应元件结合蛋白，CAMP response element binding protein)， P-CREB，FN(纤维连接蛋白)蛋白表达情况，发现糖尿病组大鼠肾功能损害明显，肾小 球增大，系膜增生，p-p38MAPK，P-CREB，FN 蛋白表达明显增加，通络方剂干预后， 明显改善肾功能，下调 p-p38MAPK，P-CREB，FN 蛋白的表达。通络方剂可能通过抑制 p38MAPK- FN 信号通路，对糖尿病肾病大鼠肾功能产生保护作用。 目的：研究 TLR 对 STZ 诱导的糖尿病大鼠肾脏 p38MAPK-FN 信号转导通路的影响，探 讨 TLR 对糖尿病肾脏保护作用的可能机制。 方法： 研究对象：健康、无特定病原体（SPF）级 SD 大鼠。CON 对照组（N＝7），糖尿 病未干预组 DM（N＝7）和糖尿病通络方剂组 DM+TLR（N＝7）。 第一部分：采用全自动生化分析仪检测大鼠静脉空腹血糖、血尿素氮、血肌酐， 尿肌酐，放射免疫法检测 24 小时尿蛋白。肾皮质 PAS 染色。电镜观察肾小球基底膜。 第二部分：蛋白质印迹分析检测肾皮质组织中 t-p38MAPK，p-p38MAPK，t-CREB(环 腺苷酸反应元件结合蛋白，CAMP response element binding protein)，P-CREB，FN 的蛋白表达。 结果： 1．一般情况：大鼠注射 STZ 1 周后，尾静脉采血测血糖16.7mmol/L，可确定糖尿病 模型制备成功，造模成功率 86.7%。此后每周监测血糖 1 次，血糖均维持在 l6.7 mmol/L 以上，模型稳定性良好。大鼠注射 STZ 后 36～48 h 出现多饮、多尿，第 3～4 天多食 明显，精神不振，毛发干枯，光泽度下降，“三多一少”症状典型。CON 组大鼠饮食、 饮水、尿量正常，毛发光亮，体质量自然增加。经通络方剂治疗后，糖尿病大鼠反应 灵敏，毛发光泽度有所增加，“三多一少”症状减轻。 2.大鼠生化指标 与 CON 组相比，DM 组大鼠平均左肾重/体重比、血糖、血尿素氮、 肌酐、24 小时尿蛋白、尿蛋白/肌酐显著增加（p0.05）。与 DM 组相比，DM +TLR 组 除血糖、尿素氮之外，这些参数是显著降低（p0.05）。 3. 肾皮质 PAS 染色 DM 组与 DM +TLR 组，可以看到肾小球增大，系膜基质增生，CON 组未显示。与 DM 组相比，DM +TLR 组大鼠基质、系膜增生较少。 4．电镜观察肾小球基底膜 DM 组与 DM +TLR 组，可以看到肾小球基底膜增厚，CON 组未显示。与 DM 组相比，DM +TLR 组大鼠肾小球基底膜增厚较少。 5. 肾皮质 t-p38，p-p38,t-CREB，P-CREB,FN 水平 与 CON 组相比，DM 组 t-p38, t-CREB 没有改变（p0.05），p-p38 增加 2.37（p0.05）,p- CREB 增加 2.21（p0.05）,FN 增加 2.03（p0.05）；与 DM 组相比，DM +TLR 组显著降低 p-p38,p- CREB, FN（p0.05）； 对 t-p38,t-CREB 没有改变（p0.05）。 结论：通络方剂可能通过抑制 p38-F