通心络通过调节mir-29a抑制平滑肌细胞的增殖的作用 机制-tongxinluo inhibits the proliferation of smooth muscle cells by regulating mir - 29a.docxVIP

万方数据 万方数据 目 录 中文摘要……………………………………………………………………1 英文摘要……………………………………………………………………4 英文缩写……………………………………………………………………8 研究论文 通心络通过调节 miR-29a 抑制平滑肌细胞的增殖的作用机制 前言……………………………………………………………………9 材料与方法……………………………………………………………10 结果……………………………………………………………………21 附图……………………………………………………………………24 讨论……………………………………………………………………36 结论……………………………………………………………………38 参考文献………………………………………………………………39 综述 miR-29 的生物学功能……………………………………………...41 致谢…………………………………………………………………………52 个人简历……………………………………………………………………53 中 中 文 摘 要 PAGE 1万方数据 PAGE 1 万方数据 通心络通过调节 miR-29a 抑制平滑肌细胞的增殖的作用机制 摘 要 目的：血管新生内膜的形成主要与血管内皮屏障受损，平滑肌细胞的 异常增殖和迁移有关。 miRNA-29a 是 miRNA-29 家族中的一员，在体内表达丰富，几乎所 有的细胞内均有表达。miRNA-29a 参与肿瘤形成、细胞因子分泌、免疫 炎症反应等多个过程。在心血管系统中 miRNA-29a 不但参与心肌纤维化， 还与动脉粥样硬化的形成密切相关。但 miRNA-29a 在平滑肌细胞增殖方 面的作用机制尚不清楚。 通心络(TXL)是一种中药复方制剂，主要功效为益气活血，通络止痛。 用于冠心病心绞痛属心气虚乏、血瘀络阻证者。通心络治疗心血管疾病已 经取得了显著的疗效。但 TXL 作为一种中药，其发挥作用的机制复杂多 样。本文主要进一步研究通心络抑制平滑肌细胞增殖和迁移的机制。 方法： 1 小鼠被随机分为对照组，miR-29awt 颈动脉结扎组，miR-29a+/+颈动 脉结扎组，miR-29awt 颈动脉结扎+通心络灌胃组，miR-29a+/+颈动脉结扎+ 通心络灌胃组。对颈总动脉进行苏木精一伊红染色观察血管内膜增生的形 态学变化，免疫组织化学染色观察颈动脉增生内膜中 PCNA 的表达量。 免疫荧光双重染色检测 YY1 和 CyclinD1 在小鼠颈动脉血管壁中的表达。 2 体外培养人血管平滑肌细胞，分别转染 miR-29a mimic 和 miR-29a inhibitor 或给予通心络预孵育，Real time PCR 检测 miR-29a 的表达水 平，Western Blot 检测 PCNA，YY1 和 CyclinD1 表达水平。细胞迁移实验 检测血管平滑肌细胞在过表达 miR-29a 后的迁移情况。 结果： 1 miR-29a 在体内和体外均促进血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖和迁 移 小鼠随机分为三组：对照组、miR-29awt 颈动脉结扎组、miR-29a+/+颈 动脉结扎组。HE 染色结果显示，miR-29a+/+小鼠组新生内膜增生更为明显， 其 I/M 比值和内膜面积均明显高于 miR-29awt 小鼠组。免疫组织化学染色 结果显示，miR-29a+/+小鼠组 PCNA 阳性颗粒明显高于其它两组。以上结 果表明，miR-29a 过表达促进颈动脉结扎诱导的内膜增生。 体外培养的人血管平滑肌细胞（HVSMCs）分别转染 miR-29a mimic （类似物） 和 miR-29a inhibitor（抑制剂）。Western Blot 结果显示，过 表达 miR-29a 后，PCNA 蛋白表达量增高。敲低 miR-29a 后，PCNA 蛋白 表达明显降低。细胞划痕实验进一步发现，过表达 miR-29a 还可以促进平 滑肌细胞的迁移。以上结果表明，在体外 miR-29a 促进 VSMCs 的增殖和 迁移。 2 miR-29a 促进 VSMCs 的增殖的分子机制与下调 YY1 表达，促进 CyclinD1 的表达有关 免疫双荧光染色，与 miR-29awt 小鼠相比， miR-29a+/+小鼠中 YY1 表 达降低，Cyclin D1 表达升高。 体 外 培 养 的 HVSMCs ， 分 别 转染 miR-29a mimic 和 miR-29a inhibitor。Western Blot 结果显示，过表达 miR-29a 抑制 YY1 表达，促进 CyclinD1 表达。以上结果提示 miR-29a 通