17β雌二醇对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡影响.docVIP

17β-雌二醇对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响 　　周开锋　茅祖斌　蒋赞利 　　[摘要]目的研究17β－雌二醇(E2)对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响。方法sD大鼠随机分为假手术组(A组)、磷酸盐缓冲液对照组(B组)及E2治疗组(c组)。应用重物打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型(A组仅行椎板切除术)，分别于伤后7、14、21及28d，按照改良Tarlov评分法和Rivlin斜板试验观察脊髓功能恢复情况。伤后6、24h和3、7、14、28d分别处死动物取材，HE染色观察病理变化，TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果TUNEL法和流式细胞术检测结果均表明大鼠脊髓损伤后存在细胞凋亡。TUNEL法显示细胞凋亡在伤后3d达高峰，c组伤后24h、3d及7d凋亡细胞比率均显著低于B组(P2能减少继发性脊髓损伤后细胞凋亡，促进脊髓功能的恢复。 　　[关键词]脊髓损伤；细胞凋亡；雌激素；神经保护 　　 　　流行病学调查显示，男性比女性更容易遭受脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)和创伤性脑损伤(traumat-ic brain iniury，TBI)，然而研究表明女性SCI和TBI患者的功能恢复情况却显著好于男性患者。近些年来，国内外越来越多的文献报道，雌激素(以17β-雌二醇为主)对中风、老年性痴呆、帕金森病等中枢神经系统退行性疾病具有神经保护作用，但是有关17β-雌二醇(17 beta-estradiol，E2)对SCI的神经保护作用的文献却极少。目前认为，细胞凋亡是SCI后迟发性神经细胞死亡的重要形式，对继发性损伤起关键作用。由于细胞凋亡是一个程序性过程，外界可以对这一过程进行调控，使在原发损伤过程中幸存的细胞继续存活，从而保留更多的神经功能。本实验旨在探讨E2对大鼠SCI后神经功能的影响。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1 实验动物分组与脊髓损伤模型的制作 　　90只成年雄性SD大鼠，体重250－300g，随机分为3组：假手术组(A组)6只、损伤对照组(B组)42只、E，治疗组(C组)42只，后两组又按SCI后不同时间点(6、24h和3、7、14、2l、28d)再分成7个亚组，每个亚组6只。参照改良的Allen’s重物打击法制作大鼠脊髓背侧损伤模型。实验前大鼠禁食8h，实验顺序随机进行。用戊巴比妥钠(30g?L-1)按40mg?kg-1腹腔注射麻醉，背部脱毛后俯卧位固定于动物手术台上，常规消毒，腰背部正中切口，逐层分开显露T8-T10椎板，行T9全椎板切除，显露硬脊膜，钳夹固定T8及T10棘突，用10.0g的不锈钢棒(直径为2.5mm)沿带有刻度的玻璃导管从25mm高处垂直下落，打击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为3mm的撞杆上，后者将打击力传递给脊髓，造成大鼠脊髓不完全损伤，致伤后迅速移开打击物，0号线逐层缝合。模型成功的判定标准：打击后，损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩样扑动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。A组仅行T9全椎板切除术作对照，c组SCI术后15min及24h按4.0mg?kg-1腹腔注射E2，E2以0.1 mol?L-1、pH7.4的无菌PBS溶解)，B组在同一时间给予等量无菌磷酸盐缓冲液(PBS，0.1mol?L-1、pH7.4)。术后分笼饲养，每天早8点及晚8点行膀胱按摩协助排尿，直至建立反射性排空。 　　 　　1.2　脊髓神经功能评价 　　所有动物均于术前及术后7、14、21及28d按改良Tarlov评分法及Rivlin斜板试验进行神经功能评价。由于大鼠昼夜活动差异，所有观察均在晚上8时由不知本实验内情但熟悉评分标准的两人同时独立进行，各自观察3次，最后取平均值。评定前使大鼠排空膀胱，以免影响结果。先按照改良Tarlov标准进行评分，30min后再进行Rivlin斜板实验。 　　1.2.1　改良Tarlov评分该法将SCI动物后肢运动功能分为0－5级：0级为无自主运动；1级为仅限于髋、膝关节的非反射性运动，无踝关节运动；2级为肢体、髋、膝、踝3个主要关节的运动；3级为能主动支持体重和不协调步态或偶尔出现协调步态；4级为前肢和后肢协调的步态，行走时有趾间关节运动；5级为正常步态。 　　1.2.2　改良Rivlin斜板试验以自制斜板(测试面附有带浅沟槽的胶皮)测量大鼠抓握能力、维持姿势能力和在斜板上维持5s不滑下的最大角度。每只大鼠测量3次，记录其不下滑的最大角度。每次测量时尽量将动物置于斜板中部上方某一固定位置，大鼠身体轴线与斜板纵轴垂直放置，斜板每次升高5度，大鼠能够停留5s的最大角度为其功能值。 　　 　　1.3　取材及切片制备 　　动物在相应时间点经脊髓神经功能评价后，取各组模型中双后肢运动功能评分接近平