Bcrabl融合基因在慢性粒细胞白血病中检测方法及意义.docVIP

Bcrabl融合基因在慢性粒细胞白血病中检测方法及意义 　　【摘要】bcr/abl 融合基因是慢性粒细胞白血病（CML）发病的分子生物学基础，通过灵敏的检验方法检测此基因对CML的诊断、治疗和预测疾病复发等具有重要临床意义。 　　【关键词】 bcr/abl 融合基因；慢性粒细胞白血病 　　【中图分类号】R733.72 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）03-0335-01 　　慢性粒细胞白血病（CML）是一种发生在造血干细胞的以粒系细胞慢性增殖为主要特征的恶性克隆性疾病，分子学水平上形成bcr/abl融合基因。bcr/abl融合基因的表达水平反映了患者体内白血病细胞的负荷量。因此，精确检测bcr/abl融合基因的表达水平，对白血病的临床分型诊断、个体化治疗方案的制定、治疗效果监测、缓解后复发风险的估计和预防、干细胞移植后残留细胞的检测和早期干预治疗等方面具有重要的指导作用。本文对bcr/abl融合基因的检测方法及意义进行综述。 　　1 Bcr/abl融合基因的检测方法 　　1.1 Southern Blot和Western Blot 　　Southern 印迹即DNA印迹，可以对bcr/abl融合基因DNA重排进行分子生物学检测。Southern Blot可使用从外周血或骨髓细胞提取的DNA对bcr/abl融合基因进行检测，不需要保持细胞的活力和所处周期，灵敏度约1～5%，多适用于科研而不是临床诊断[1]。 　　Western 印迹的原理类似Southern印迹，它是从混合蛋白质中区分并定量分析某种特殊蛋白质的重要手段[2-3]。但由于不同蛋白质的电转移效率以及单抗的结合能力不同，Western印迹的敏感性和可重复性较差，其敏感性为0.5%～1%[4]。另外该法操作繁琐、检测时间长，限制了其在临床上的应用。 　　1.2 常规RT-PCR 　　1988年RT-PCR被首次应用于CML的bcr/abl基因的检测[5]。在RT-PCR中，应用随机引物或abl特异引物，mRNA被反转录为cDNA，随后应用针对M-bcr的bl或b2和abl的a2或a3的引物进行扩增，扩增产物在琼脂糖或聚内烯酰胺凝胶电泳中出现特异的条带，在典型的CML病例中，b3a2和b2a2扩增产物条带相差75bp。常规RT-PCR的灵敏度为10-3～10-6。巢式PCR（Nested PCR）通过对第一轮的扩增产物进一步扩增，产生片段更短的PCR产物，敏感度提高到10-5～10-7。定性PCR技术己经普遍用于造血干细胞移植后MRD检测。但定性PCR中不可避免地存在着假阳性或假阴性，所以，有必要应用定量PCR的方法对移植后患者进行微小残留病变的动态监测。 　　1.3 实时定量PCR 　　所谓RQ- PCR技术是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前国内外已发展了数种 RQ-PCR 技术，其中 TaqMan 法简单易行、特异性好、假阳性低、线性关系好，整个过程采用全封闭反应管及光电传导系统，无须顾及污染，亦无须对样品进行稀释和电泳，已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、基因表达、突变和多态性研究等多个领域[6]。其工作原理是利用Taq 酶的5′→3′核酸外切酶活性。在PCR 反应系统中加入一个荧光标记探针，该探针的5′端和3′端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光团。当探针保持完整时，淬灭基团抑制荧光基团的荧光发射。荧光基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，荧光基团被荧光探测系统检测到。上述方法利用荧光产生原理，在PCR 过程中可以连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。所以RQ-PCR实现了从定性到定量的飞跃，其优点分别为：①灵敏度高，可达10-5，能区分转录本2～3倍变化[7]。②可靠、可重复：利用管家基 　　因可以对结果标准化，结果的可重复性好、可靠。③操作简便、快速、污染小、安全：可以通过外周血标本检测，减少了骨髓穿刺创伤且可以处理批量标本。整个PCR和检测过程由电脑控制，完整的RQ-PCR分析耗时不超过60分钟。扩增产物及产物分析在同一个反应体系中完成，不需PCR后处理，杜绝了扩增产物污染造成的假阳性。④定量监测：可以动态观察转录水平的变化，对疾病状态进一步分层，有利于早期疗效分析和指导个体化治疗。因此可作为CML治疗后监测MRD的有效手段。 　　2RQ-PCR检测bcr/abl融合基因的临床意义 　　2.1 CML临床分型与分期 　　依据Ph染色体和bcr/abl融合基因，90%以上慢粒同时表现为Ph阳性和bcr/abl阳性，在Ph阴性患者中，又有5%左右患者 bcr/abl阳性，称为Ph阴性和bcr/abl