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10种藤黄科植物遗传多样性的ISSR分析 　　摘要：运用内部简单重复序列（inter-simple sequence pepeat，ISSR）分子标记对采自海南省的10种藤黄科植物进行遗传多样性分析，结果显示：（1）从100条ISSR引物中筛选出8条能扩增出清晰条带且多态性明显的引物；8条引物扩增出331条条带，其中多态性位点有106个，多态性比例为100%，平均每条引物扩增位点数为13.25个。（2）材料间的遗传相似系数范围为0.407 8～0.699 0，平均为0.562 2。以0.620 0作为最低遗传相似系数，将10种藤黄科植物划分为5大类：①铁力木；②菲岛福木、单花山竹子、山竹子；③多花山竹子、越南黄牛木、黄牛木；④岭南山竹子；⑤红厚壳、薄叶红厚壳。研究结果首次从分子水平揭示了藤黄科植物的遗传多样性，为合理地引种、驯化、保护、利用藤黄科植物野生资源提供了重要的参考依据和数据支持。 　　关键词：藤黄科；ISSR；遗传多样性；聚类分析；相似系数 　　中图分类号： S567.1+90.32 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0055-04 　　藤黄科（Guttiferae）属双子叶植物纲五桠果亚纲，是一个热带科。我国有8属87种藤黄科植物，分别隶属于3亚科，几乎遍布全国各地[1]，海南省主要有黄牛木属、红厚壳属、铁力木属、藤黄属等。近年来，随着人们对藤黄科植物研究的不断深入，从中出离出大量黄酮类化合物[2]、?愣滞?类化合物[3-4]、萜类化合物[5]等。药理研究表明：藤黄科植物药用活性成分具有抗肿瘤[6]、抗艾滋病[7]、抗菌[8]等多种生物活性，极具研究和开发价值。因此，对藤黄科植物进行深入研究具有重要意义。 　　内部简单重复序列（inter-simple sequence pepeat，ISSR）是由Zietkiewicz等在1994年提出的一种新型分子标记技术[9]，用于检测简单重复序列（SSR）间的DNA序列差异，具有比随机扩增多态DNA（RAPD）更高的可重复性、稳定性[10]。同时，该试验操作简单、快速、高效，不需要繁锁的构建文库、设计引物、杂交、同位素显示等步骤，而且ISSR标记可以揭示整个基因组的一些特征，并呈孟德尔式遗传。目前，ISSR技术己在品种鉴定[11]、遗传作图[12-13]、遗传多样性[14-15]等研究中得到了广泛应用[16]。本研究利用ISSR技术对采自海南省的10种藤黄科植物进行亲缘关系、遗传多样性分析，以期为藤黄科植物种质资源的收集、鉴定、保护和利用提供理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　供试材料分别为红厚壳、薄叶红厚壳、山竹子、岭南山竹子、单花山竹子、多花山竹子、菲岛福木、黄牛木、越南黄牛木和铁力木，所有物种均由海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室主任杨小波教授鉴定。采集地信息见表1。 　　ISSR-PCR扩增反应引物根据British Columbia大学公布的ISSR引物序列，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成；Taq DNA聚合酶、2×Taq PCR Master Mix、2 kb DNA marker均购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。 　　1.2 试验仪器 　　主要仪器有：HH-2数显恒温水浴锅；Eppendorf Centrifuge 5 415R冷冻离心机；Biometra TGradient PCR仪；DYY-11型电泳仪，北京市六一仪器厂；BG-SubMINI水平电泳槽；Alphalmager-2200凝胶成像系统。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 总DNA的提取 采用购自成都福际生物技术有限公司的植物DNA提取试剂盒提取基因组总DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性、浓度，将其稀释为 20 ng/L，用于ISSR分子标记技术分析，置于-20 ℃冰箱中保存备用。 　　1.3.2 扩增与成像 ISSR-PCR反应体系（20 μL）：10 μL 2×Taq PCR Master Mix，1 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），1 μL 模板，用灭菌蒸馏水补足至20 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min，45 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s；94 ℃ 50 s，43 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 10 min。于4 ℃贮存。PCR扩增在Biometra T-Gradient PCR仪上完成。ISSR扩增产物用1.6%琼脂糖凝胶电泳检测，以2 kb Ladder Plus Marker为相对分子质量标记，在紫外凝胶成像系统下拍照记录。 　　1.3.3 数据处理 对ISSR-PCR扩增产物进行条带数目统计，