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NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中表达纯化及其应用 　　摘 要 为获得稳定表达及较好免疫效力的重组NNV衣壳蛋白，对已公布的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列进行优化，并构建表达载体pET32a-NNV，于大肠杆菌BL21（DE3）中诱导、表达，将包涵体纯化后碾磨成粉添加到黄粉虫饲料中，用虫体粉末喂食石斑鱼，攻毒保护试验检测免疫效力。结果获得高表达的NNV衣壳蛋白包涵体，目的蛋白占总蛋白的比率达70%，纯化后纯度达95%；且喂食本技术制备的黄粉虫粉末后石斑鱼对NNV抵抗力显著提高，存活率由5%上升至83%。本研究提供一种重组NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中高效表达和纯化方法，为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推?V奠定了基础。 　　关键词 石斑鱼；神经坏死病毒；衣壳蛋白；疫苗 　　中图分类号：S943 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.06.063 　　石斑鱼是一种重要的经济鱼类。神经坏死病毒（NNV）可攻击石斑鱼的神经系统，造成致命性的病毒脑病和视网膜病变[1]，是鱼苗培育过程中重大病害之一。一旦爆发，会造成仔、稚鱼的大量死亡，成为制约石斑鱼养殖业发展的瓶颈。目前，应对方法主要是阻断传播途径、筛选未携带病毒的亲鱼以切断垂直传播、利用碘试剂等消毒方法以减少水平传播，但前者受检测灵敏度限制，后者无法确保消毒彻底，因此疫苗是防治石斑鱼神经坏死病的重要方法之一。至今已基于大肠杆菌、昆虫细胞和酵母系统成功表达NNV主衣壳蛋白，电镜下可见病毒样颗粒形成，动物实验显示其具有良好的免疫原性[2]。然而传统注射重组病毒样颗粒的免疫方法，虽然对较长鱼苗具有较好的免疫保护作用，但对特异性免疫还未成熟的石斑鱼稚苗来说，则很难达到防治的目的，因而通过开发口服类疫苗被动免疫稚鱼，将是针对稚鱼免疫系统特点的较为有效的一种预防措施[3]。 　　因此本研究以制备稳定表达以及较好免疫效力的NNV衣壳蛋白为出发点，利用基因工程技术获得高表达的NNV衣壳蛋白包涵体，并建立了一种操作简单、可行性强的喂食免疫方法，为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推广提供了可能性，具有广阔的市场前景。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验材料 　　pET32a原核表达载体，大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）由本实验室保存。健康斜带石斑鱼（Epinephelus coioids）以及黄粉虫（Tenebrio molitor）均由福建水产研究所提供。 　　1.1.2 试剂 　　限制性内切酶、连接试剂盒、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉、预染蛋白marker，均购自赛默飞；IPTG，购自麦克林。 　　裂解液：10 mmol?L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol?L-1 NaCl、125 mmol?L-1 咪唑。缓冲液B1：10 mmol?L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol?L-1 NaCl、1% TritonX-100。缓冲液B2：10 mmol?L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol?L-1 NaCl。均由本实验室配制和保存。 　　1.1.3 仪器 　　超净工作台，购自AIRTECH；恒温摇床购，自上海智城分析仪器制造公司；均质机，购自AVESTIN；超速离心机，购自Thermo Scientific；电泳仪，购自Bio-Rad；凝胶成像仪，购自上海复日科技有限公司；冷冻干燥机，购自上海皓庄仪器有限公司。 　　1.1.4 培养基 　　液体培养基：LB培养基、氨苄青霉素抗性LB培养基（抗生素浓度为50 μg?mL-1）；氨苄青霉素抗性固体培养基： 　　LB液体培养基+1.2%琼脂粉（抗生素浓度为50 μg?mL-1）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PCR引物设计 　　检索NCBI数据库得NNV衣壳蛋白基因序列（accession： KC696562.1），并对其进行优化，第15～18个氨基酸由TKAA变为RG。引物序列设计如下，上游引物：5’-CATGCCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’（划线部分为NcoⅠ酶切位点）；下游引物：5’-CCGCTCGAGTTAAGTGCAGACAGTGCC-3’（划线部分为XhoⅠ酶切位点）。基因和引物序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。 　　1.2.2 PCR扩增目的基因 　　扩增条件为：95 ℃预变性3 min，设定每个循环为95℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，34个循环结束后72 ℃再延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用Omega胶回收试剂盒回收目的片段。 　　1.2.3 载体构建 　　将pET-32a载