SCAR分子标记在甘蓝型油菜S单倍型分类中应用.docVIP

SCAR分子标记在甘蓝型油菜S单倍型分类中应用 　　摘要根据克隆到的ISLGa片段与ISLGb片段核苷酸序列之间的差异,发展了1个SCAR分子标记ISLGb(ISLGb-L+PS15),其引物只在具有ISLGb基因型的3个材料中扩增,并且均得到了大小为1 265bp的单一亮带。通过与已有的相关分子标记整合得到了1套SCAR分子标记体系。包括2个多重PCR分子标记:①ISLG(PS5+PS15)和SP110(SP11-L+SP11-R)用于鉴别ISLG和IISP11b;②ISLGb(ISLGb-L+PS15)与SP11a(SP11-L+SP11-R)用于鉴别ISLGb和IISP11。还包括1个单PCR分子标记:SRKa(S40-5+S60-2)用于鉴别IISRKa。 　　关键词SCAR分子标记;甘蓝型油菜;S单倍型;分类 　　中图分类号 S565.4 文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)01-0029-02 　　 　　自交不亲和(Self-incompatibility)是杂种优势利用的重要途径之一,与细胞质雄性不育相比,自交不亲和系杂种具有不受特定胞质的限制、无潜在的不良胞质效应,恢复系广泛、制种产量高等优点。在芸薹属的6个种中,3个基本种,白菜(AA,2n=20)、甘蓝(CC,2n=18)和黑芥(BB,2n=16)表现自交不亲和,而3个复合种包括甘蓝型油菜(AACC,2n=38)、芥菜型油菜(AABB,2n=36)和埃塞俄比亚芥(BBCC,2n=34)表现为自交亲和。虽然对白菜和甘蓝已经做了大量的研究,找到了与自交不亲和性紧密连锁的3个基因,但对甘蓝型油菜的研究很少,对甘蓝型油菜自交不亲和性的分子机理尚不了解。而对甘蓝型油菜的S单倍型进行分类,有助于在一定程度上阐述甘蓝型油菜自交不亲和性的分子机理。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1试验材料 　　研究所用材料为来自国内外的125份普通甘蓝型油菜材料[1],用于建立SCAR(Sequence Characterized Amplified Reg-ions)分子标记体系鉴别自交不亲和S单倍型。其中甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300作为母本[2],其他124份甘蓝型油菜作为父本。 　　 　　1.2试验方法 　　1.2.1DNA提取和PCR扩增。选取苗期的油菜鲜嫩叶片0.1~0.2g,用CTAB小量法提取DNA。把DNA浓度调至50 ng/μL左右,以此为模版进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系是:100ng模板DNA,各50ng正向和反向特异引物,1×PCR 缓冲液,1 U Taq 酶,0.15mmoL/L dNTPs 和 2.0mmoL/L Mg2+,加ddH2O至总体积20μL。先用双亲做温度梯度试验,确定适宜的退火温度和时间。将扩增得到的产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。 　　1.2.2PCR扩增产物片段回收、克隆、测序。取30μL PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测,在紫外灯管下用刀片切下目标带,然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司)回收。将回收的片段进行T-A克隆,然后每个片段选3个阳性单克隆菌样送至南京金思特科技有限公司测序。 　　 　　2结果与分析 　　 　　2.1SCAR分子标记 　　张幸果利用分子标记方法对来自国内外的125份甘蓝型油菜的S单倍型进行了基因型的分类,将甘蓝型油菜分为11种基因型[1]。其中并发展了一个CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)分子标记用于区分ISLGa和ISLGb,但因为CAPS分子标记酶切时间太长,不利于简单、快速检测,因此本试验尝试发展SCAR分子标记。 　　对ISLGa、ISLGb片段测序,其长度分别为1 336、1 345bp,ISLGb与ISLGa的1 336bp相比,具有3个片段的插入,长度分别为6、3、3bp以及1个3bp片段的缺失。在6bp的插入处设计1条引物ISLGb-L(5′TCCTGCCCTTTCGATGTATTT3′),与PS15[3]构成引物对,为特异扩增ISLGb的分子标记ISLGb。并且该标记引物ISLGb-L+ PS15在3个材料(Profit、Maskot、Puma)中均扩增出大小为1 265bp的单一亮带,其退火温度为60℃。另选取基因型为ISLGa的3份材料用此引物扩增,未发现扩增产物(见图1)。 　　 　　2.2多重PCR分子标记 　　多重PCR(multiplex PCR)又称多重引物PCR或复合PCR,是指在同一PCR反应体系中加入2对或2对以上的引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR