siRNA沉默FOXF2基因对宫颈癌Hela细胞迁移与增殖影响.docVIP

siRNA沉默FOXF2基因对宫颈癌Hela细胞迁移与增殖影响 　　[摘要]目的研究siRNA沉默FOXF2基因对宫颈癌Hela细胞迁移与增殖的影响。方法采用Real Time-PCR、WesternBlot法检测siRNA沉默FOXF2后，Hela细胞中FOXF2基因mRNA、蛋白表达的变化；用划痕试验检测siRNA沉默FOXF2后细胞的迁移能力，CCK8检测siRNA沉默FOXF2后细胞的增殖能力。结果Hela细胞内FOXF2基因沉默后，Real Time-PCR、Western Blot检测显示siRNA沉默FOXF2组FOXF2基因mRNA、蛋白的表达均明显下降（P0.01）；划痕试验显示细胞迁移能力增强（P0.01）；CCK8检测显示siRNA沉默FOXF2组细胞增殖能力增强（P0.01）。结论SiRNA沉默FOXF2基因促进Hela细胞的迁移与增殖能力。 　　[关键词]宫颈癌；FOXF2；细胞迁移；细胞增殖 　　[中图分类号]R737.33 　　[文献标识码]A 　　[文章编号]2095-0616（2017）03-30-04 　　宫颈癌是妇科最常见的生殖道恶性肿瘤之一，在全球其发病率仅次于乳腺癌。死亡率在妇科生殖道恶性肿瘤中占首位，其主要原因是肿瘤的侵袭及转移。当前宫颈癌的治疗方案主要是手术治疗、放疗、化疗、生物治疗及综合治疗等，多半在破坏肿瘤的同时，其对正常的细胞组织也产生了或多或少的损伤。该疾病的发病原因涉及致癌基因的激活和或抑癌基因的失活以及表观遗传学的改变等，是多阶段、多因子的复杂调控过程。现宫颈癌明确的病因和发病机制尚不明确，其靶向治疗是科学界较热门的研究内容。又头框转录因子F2（forkheadboxF2，FOXF2）蛋白是FOX家族的重要成员，它的特点是高度保守的DNA结合结构域和组织特异性表达模式，它在细胞的生长和分化、调节胚胎的生成，和组织发展起着重要的作用。最近的研究表明，FOX基因的失调与肿瘤发生和肿瘤进展相关。有研究表明，FOXF2的低表达与乳腺癌患者的早发性转移和预后不良相关。目前仍无FOXF2基因与宫颈癌的相关性报道。本研究从分子水平来阐述宫颈癌的发病机制，为宫颈癌分子靶标治疗的筛选提供有力依据。 　　1.材料与方法 　　1.1材料 　　人宫颈癌Hela细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，natocor），DMEM购自美国Gibco OptiMEM@I Medium和转染试剂脂质体Lipofectaminetm 3000?自美国Invitrogen公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Coming公司。RT-PCR试剂购自日本Takara。FOXF2 siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，包含3条目的siRNA链，1条阴性对照siRNA链。Si-FOXF2 1305序列为：5’GCAUCACUCUACU CCAGUGTT-3’；Si-FOXF2 1415序列为：5’-GCGUCUGUCAGGAUAUUAATT-3’；Si-FOXF2 650序列为：5’CCAGCGAGUUCAUG UUCGATT-3’；阴性对照组（si-negative control）siRNA序列为：5’-UUCUUCG AACGUGUCAC GUTT-3’。兔抗人FOXF2 Ab、兔抗人GAPDH Ab购自美国Abcam公司。Hela细胞分为5组：Hela SNC组、Si-FOXF21305组、Si-FOXF2 1415组、Si-FOXF2 650组及未经任何处理的Hela细胞作为对照组。 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养Hela细胞复苏，加入含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素及10%FBS的DEME中培养，置入37℃、5%CO2培养箱内，24h内更换培养液。对数生长期时，用0.25%胰酶消化、传代、冻存。 　　1.2.2细胞转染转染前一天将Hela细胞接种于6孔板中，转染时细胞融合达到30%一40%，PBS洗涤3遍，每孔加入900uLOptiMEM@IMedium。将3uL的Lip03000和5uL的siRNA分别与50uL的optiMEM@I Medium混悬，轻轻混匀后静置5min。将含有Lip03000和siRNA的OptiMEM@I Medium轻轻混匀后静置20min。将混匀的100uLDNA脂质体复合物均匀滴入含有optiMEM@I Medium的细胞中。48h后提取RNA。 　　1.2.3 Rea]Tme-PCR检测各组FOXF2 mRNA的表达终点提取RNA，采用紫外/可见光分光光度仪测量细胞样品总RNA的浓度和纯度，（A