IPTG诱导剂对C型产气荚膜梭菌β2毒素基因表达影响.docVIP

IPTG诱导剂对C型产气荚膜梭菌β2毒素基因表达影响 　　摘要：对已构建的含β2毒素基因重组质粒pETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定，并用SDS检测不同培养条件下β2毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实，pETXB2重组质粒含有β2毒素基因而且阅读框架和基因序列正确。同时采用IPTG诱导剂在改变培养基的pH、培养温度、诱导剂的加入量及诱导时间4个方面对β2毒素基因表达进行调控，其最佳的表达条件是37 ℃，pH 7.0的培养基中，用终浓度为0.8 mmol/L IPTG诱导4 h，β2毒素蛋白的表达效果最好。 　　关键词：C型产气荚膜梭菌；β2毒素基因；优化表达 　　中图分类号：S852；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）03-0749-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.051 　　Abstract： An identification of recombinant plasmid pETXB2 containing β2-toxin gene was conducted with restriction endonuclease enzyme digestion， and the expression levels of β2-toxin gene under different cultural conditions were detected. By enzyme digestion identification， the recombinant plasmid pETXB2 contained β2-toxin gene and have positive reading frame. Meanwhile IPTG was adopted as inducer to regulate and control expression of the β2-toxin gene in four aspects of changing medium pH， culture temperature， amount of inducer， and inducing time. Results showed that， the optimal condition was the temperature 18 ℃， medium pH 7.0， final concentration 0.8 mmol/L IPTG， inducing time 4 hours， the expression effect of β2-toxin protein was optimized under the condition. 　　Key words：Clostridium perfringene type C； β2-toxin gene； optimal expression 　　产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens） 是人类和动物主要的病原体，可引起肠道和组织感染，是多种肠毒血症、肠炎、食物中毒和气性坏疽的主要病原菌之一[1-4]。产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性梭状芽孢杆菌，可产生至少17种毒素，其中主要毒素为α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素，根据产生的毒素类型将其分为A、B、C、D和E 5种毒素型[5-8]。作为一种重要的病原体，产气荚膜梭菌广泛分布于水和食物等各种环境，此外在人和多种动物的肠道菌群中也普遍存在。产气荚膜梭菌以芽孢和繁殖体形式栖居在土壤里，由于其能产生具有抵抗力的芽孢，已成为水污染重要的指示菌[9-11]。 　　产气荚膜梭菌所有的菌型均产生α毒素，B型和C型主要产生β毒素，B型和D型主要产生ε毒素，E型主要产生ι毒素[12]。研究人员一直认为C型产气荚膜梭菌产生的β毒素只有一种，但新近研究表明其可产生β1和β2两种毒素，其中β2毒素是更重要的毒力因子，β2毒素与β1毒素及其他毒素均没有显著的氨基酸序列同源性，但与β1毒素具有相似的生物学活性，对于肠细胞都具有细胞毒性并且小剂量毒素即可导致小鼠死亡[13-15]。目前，鲜见国内关于β2毒素基因克隆与表达调控的报道，本试验克隆了β2毒素基因并明确了其核苷酸序列，同时以IPTG为诱导剂和改变培养条件对β2毒素基因表达进行调控，实现目的蛋白表达的最大化，从而为下一步大规模工业化生产β2毒素基因工程亚单位疫苗奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 菌株和质粒 　　C型产气荚膜梭菌强毒菌C59-44购自中国兽药监察所；受体菌JM109、BL21（DE3）、载体pET- 28c由吉林化工学院分子生物学实验室保存；质粒pGEM-T购自Promega公司。