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x果炭疽病抗性杂交群体构建及SSR分子标记鉴定 　　摘要：以对炭疽病高抗的金煌品种为母本，高感的爱文品种为父本构建?x果炭疽病抗性杂交群体，共获得杂交果实219个，培育杂交实生种苗184株。按花朵统计结实率为218％。通过对184株杂交种苗进行SSR分子标记鉴定，结果表明，16对引物中15对能够有效扩增产物；12对具有丰富的多态性；8对在父母本之间具有多态性，184株杂交种苗可以确认是真实杂种，应用SSR分子标记技术可以对?x果杂种的真实性进行快速验证。 　　关键词：?x果；炭疽病；杂交群体构建；SSR；杂种鉴定 　　中图分类号：S667.7　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2010)02-265-05 　　 　　?x果炭疽病是?x果最严重的病害，此病在国内外?x果产区普遍发生，以高抗品种金煌为母本，高感品种爱文为父本进行人工杂交授粉，以期建立?x果炭疽病抗性杂交群体。由于?x果人工杂交授粉技术在我国一直是个难题，杂种的真实性有必要进行鉴定，在应用SSR(简单重复序列)分子标记方法进行?x果相关研究方面，主要集中在品种鉴定、遗传多样性分析等方面，有关应用SSR分子标记方法进行?x果杂种真实性鉴定未见报道，我们以SSR分子标记方法进行?x果杂种真实性鉴定，以期建立一种新型、准确、快速有效的分子生物学检测?x果杂种真实性的方法。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　杂交授粉 　　试验于2007年11月下旬至12月上旬在海南三亚广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场?x果试验基地进行，以对炭疽病为高抗的金煌品种为母本，高感的爱文品种为父本，采用姚全胜等?x果杂交授粉方法进行授粉试验，共授粉679个花序，10066朵花。亲本对炭疽病的抗性结论依据雷新涛等的鉴定结论。 　　 　　1．2　杂种鉴定 　　1．2．1　基因组DNA的提取、检测、PCR扩增、电泳检测　2008年7―8月分3次采集杂交种苗幼叶材料，2008年7月在杂交授粉地采集亲本幼叶材料，参照王家保等的方法提取?x果DNA并进行检测。使用德国Whatman Biometra公司生产的T1型扩增仪进行PCR扩增，反应体系如下：2μL10×Ex TaqBuffer、1.6μL25mmol?L-1MgCl2、0.25μL4×dNTPMixture、1μL10μmol?L-1Forward primer、1μL10μmol?L-1Reverse primer、2μL20mg?L-1基因组DNA、0.15μL5U?μL-1Taq DNA polymerae、12μLddH2Oo。扩增程序为：预变性94℃2min30s：变性94℃30s，退火48～54.4℃45s，延伸72℃1min；循环数为35，最后72℃延伸5min，4℃保存备用。电泳检测采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，120V稳压电泳1.2～1.5h，电泳结束后银染显色，并对条带进行观察记录。 　　1．2．2　SSR引物及其退火温度的优化与多态性分析　根据Viruel等的结论合成引物，引物序列如表1所示，引物合成由上海英骏公司完成。按1.2.1PCR扩增方法优化退火温度，设定退火温度为(48～68℃)，PCR仪自动生成12个温度梯度：48、49、50、52、54.4、56.8、59．2、61.6、64、66、67、68℃。根据雷新涛等的结论，用16对引物分别对亲缘关系较近的11个品种(包括亲本)爱文、金煌、Carbao、海豹、台农1号、Zill、粤西1号、Spooner、小菲、白象牙、串?x进行多态性分析，筛选能够进行杂种鉴定的引物序列。 　　 　　1．2．3　杂交群体的SSR分子标记鉴定　根据引物的多态性分析结果，选取在父母本之间具有多态性的引物共8对进行杂交种苗的亲本真实性鉴定，在这8对引物中有4对引物具有以下特征：每个杂交种苗的电泳条带与父本或母本之间没有多态性，根据这个特征判断电泳条带与父本之间没有多态性的杂交种苗为真实杂种。有1对引物具有以下特征：父本电泳条带只有一个位点且与杂交种苗电泳条带无多态性，判断有这个特征的杂交种苗也为真实杂种。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2．1　杂交授粉结实率 　　于2008年4月收到杂交果实219个，2008年7月获得杂交种苗184株。结实率按花朵统计为2.18％，杂交果实播种出苗率为84.02％。 　　 　　2．2　SSR引物的退火温度与多态性 　　经过优化，不同引物的退火温度如表2所示，图1为引物Lmma7、Lmma8的优化退火温度电泳图。经分析，不同引物在11个品种间和父母本之间具有丰富的多态性，16对引物中15对能有效扩增，其中12对在11个不同品种中表现出丰富的多态性，多态性引物占75％。大部分多态性引物可