β淀粉样蛋白对AD大鼠海马Beclin1表达及学习记忆影响.docVIP

β淀粉样蛋白对AD大鼠海马Beclin1表达及学习记忆影响 　　摘要 研究β淀粉样蛋白（25-35）对阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1的表达和学习记忆功能的影响。通过行为学以及免疫组织化学检测，观察模型大鼠学习记忆功能以及海马Beclin-1表达的变化。行为学检测表明：模型组的学习记忆功能明显低于正常组，模型组Beclin-1表达明显降低（P0.01）。海马CA1区注射β淀粉样蛋白（25-35）大鼠学习记忆力下降，Beclin-1表达下调，提示Beclin-1蛋白的表达降低很可能是β淀粉样蛋白（25-35）致神经元可塑性降低的关键环节。 　　关键词 阿尔茨海默病；β淀粉样蛋白（25-35）；Beclin-1 　　中图分类号 R322.81 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）12-0303-02 　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以学习、记忆和认知受损为主要特征的神经退行性疾病[1]。目前，科学研究认为，AD是一种多病因的疾病，确切的发病原因还未探明。在众多发病机制的学说中，Aβ级联假说（amyloid cascade hypothesis）[2]与Aβ沉积假说占有重要的地位。特别是Aβ的沉积导致老年斑及tau样蛋白及慢性炎性反应，最终导致神经元的功能减退、出现痴呆等[3]。体外研究[4]表明，Aβ形成过程与自噬相关蛋白Beclin-1的表达有关。而在体的相关研究却鲜有报道，为探讨脑内自噬相关蛋白Beclin-1的表达及Aβ沉积与AD模型大鼠学习记忆能力之间的关系，进行了试验研究，现将结果报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验动物 　　采用200～250 g、健康雄性SD成年大鼠，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，按标准大鼠饲料常规饲养。 　　1.2 仪器设备和试剂 　　Aβ25～35购自Sigma公司，Beclin1（H-300）兔多克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology产品；Morris水迷宫（中国医学科学院产品）、脑立体定位仪（NAR ISA IGE SN-2）。 　　1.3 AD模型制备 　　SD大鼠，经Morris水迷宫测试判定其空间辨别性学习记忆能力，淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠，将选出的大鼠随机分为2组，即模型组（AD）、对照组（NS），每组12只。AD组双侧海马区注射点（AP-3.5ｍｍ，ML±2.0ｍｍ，DV2.7 ｍｍ）[5]用微量进样器（上海高欣玻璃仪器厂产品）注射5 μL（10 μｇ）Ａβ25～35（聚集态的Ａβ25～35形成），10 min内注射完毕。NS组注射等量的生理盐水。各组术后均单笼饲养至大鼠完全清醒。动物自由摄食、饮水。 　　1.4 Morris水迷宫行为学试验 　　1.4.1 定位航行试验。水池分为N、E、S、W 4个象限。试验前一天将大鼠放入水池（不含平台）自由游泳2 min，使其熟悉并适应水迷宫环境。试验历时5 d，每天分上午（n-1）、下午（n-2）2个时间段，每段分别训练4次。训练开始时将平台置于SW象限，每个时段分别从池壁4个起始点将大鼠面向池壁放入水池，记录每次找到平台的游泳路径[5]。如大鼠在120 s内找不到平台，由试验者将其引上平台，潜伏期记为120 s，并记录为1次寻找站台错误，每次间隔4 min让大鼠休息，再进行下次试验[6-7]。 　　1.4.2 空间探索试验。在第5天下午第5次训练时拆除水下平台，然后任选1个入水点将大鼠面向池壁放入水中，测其120 s内在各象限的游泳距离及占总距离的百分率，以及120 s内跨越各象限平台相应位置次数及占总次数的百分率，并记录大鼠120 s内搜索平台的路线图。 　　1.5 大鼠脑组织Beclin-1表达水平检测 　　免疫组化SP法检测大鼠脑组织中Beclin-1的表达：切片经二甲苯脱蜡，酒精脱水后，3%过氧化氢液中封闭内源性过氧化酶活性，置于0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（pH值6.0）中，抗原修复后，滴加山羊血清工作液，封闭非特异性抗原。滴加Beclin-1多克隆抗体，工作稀释度为1∶50，37 ℃恒温箱内孵育，4 ℃湿盒内过夜，滴加生物素化二抗，滴加链亲和素-生物素过氧化物酶复合物，DAB显色，适时终止。苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片，镜下观察。每批试验均设有阴性对照，以磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。染色阳性结果为细胞膜或细胞质突起着棕黄色。每只大鼠重复观察2张切片，每张切片随机选取5个视野，应用Image Pro Plus 5.0图像分析系统计数每个高倍（×400）视野阳性细胞个数，取平均值代表每只大鼠的阳性染色强度。 　　1.6 统计学处理