PMI基因作为选择标记植物表达载体构建及转化白花丹参体系建立.docVIP

PMI基因作为选择标记植物表达载体构建及转化白花丹参体系建立 　　[摘要] 目的： 构建含有大肠杆菌6- 磷酸甘露糖异构酶（6-phosphomannose isomerase，PMI）基因并替换潮霉素抗性（hygromycin， hyg）基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI，同时建立以PMI/甘露糖为筛选标记的白花丹参转基因体系。方法：首先从大肠杆菌Escherichia coli DH5α中克隆PMI基因，然后以PMI基因替换植物表达载体 pCAMBIA1305 中的hyg基因，构建了以PMI 基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI，并用电击转化方法导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404 中，用叶片浸染法转化白花丹参。结果：在白花丹参MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1固体分化培养基中附加20 g·L-1甘露糖和10 g·L-1蔗糖为碳源的选择压力下，pCAMBIA1305-PMI 的转化率为23.7%，对再生植株用PCR检测证实了PMI基因的导入。结论：建立了以PMI-甘露糖为选择系统的白花丹参转基因体系，可应用于后续目的基因的转化奠定了基础。 　　[关键词] 6-磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因；甘露糖；白花丹参；转基因筛选标记 　　传统方法获得的转基因植物中存留的抗生素筛选基因可能会危害人类肠道内的正常菌落或传播到周围环境中引起基因污染。虽然目前还没有关于标记基因迁移带来危害的报道[1]，但抗性标记基因潜在的生态环境和食用安全性一直颇具争议。因此，培育具有无抗生素的生物安全性标记基因的转基因植株势必成为未来植物转基因的重要发展方向。 　　6-磷酸甘露糖异构酶（phosphomannose isomerase，PMI）基因编码 6-磷酸甘露糖转移酶，其产物可催化 6-磷酸甘露糖转变为 6-磷酸果糖。自然界的植物大多没有PMI 基因（ manA），在含甘露糖的培养基上，内源果糖激酶催化甘露糖磷酸化为 6-磷酸甘露糖，从而使ATP 大量消耗。而催化产物 6-磷酸甘露糖不能被植物细胞利用，当其积累到一定程度时就会对细胞生长起到抑制作用。只有转入了外源PMI 基因的转化细胞才能继续代谢 6-磷酸甘露糖，并生产出 ATP，为细胞正常生长提供能量。所以，甘露糖在遗传转化中是一个有用的选择剂，使用PMI基因作为筛选方式的转基因系统要求在含有甘露糖的培养基上有生长优势。PMI作为新型安全的选择标记应用于植物的遗传转化，筛选程序简单、筛选剂价格低廉，而且不影响转化植株的代谢平衡和生长发育，不利变异少，筛选效果显著，对人体和环境无污染，在单子叶植物和双子 　　叶植物中均适用。利用此正选择系统转化甜菜，其转化频率是卡那选择系统的 10 倍[2]。另外在白菜、油菜籽、杨树和杏树等多种植物的基因工程研究中也有应用[3-7]。 　　白花丹参Salvia miltiorrhiza bge. f. alba C. Y. WU et H.W. Li是紫花丹参的变型，为山东特产药材之一。已做为一个新品种被收录进《山东省中药材标准》（2000 年版） [8-9]。白花丹参与丹参的化学成分基本相同，含有脂溶性成分丹参酮类，水溶性成分酚酸类，可以作为丹参的替代品。甘露糖为筛选剂的转化丹参的研究未见有报道。本研究首先构建了以PMI 基因作为筛选标记的植物表达载体并转化白花丹参，以期建立起具有生物安全性的白花丹参转基因体系， 为白花丹参的遗传改良提供技术资料。 　　1材料 　　大肠杆菌Escherichia coli DH5α、农杆菌LBA4404和植物表达载体pCAMBIA1301由本实验室保存。pMD18-T Vector载体、Taq DNA 聚合酶、DNA限制性内切酶、DNA Marker DL15000购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒等购自宝生物公司。 　　2方法 　　2.1植物表达载体pCAMBIA1305-PMI的构建 　　用引物PMIF 5′ AAAACAGGGATTGATCAT 3′和PMIR 5′TTTCAGTAAGCTCTTACAGC 3′从大肠杆菌基因组中扩增PMI基因，然后连接到pMD18-TVector得到pMD18-T-PMI载体，测序验证。然后用带有XhoI接头的引物PMIxhou5′AGTCTCGAGATGCAAAAACTCATTAAC3′和PMIxhol5′CAGCTCGAG TTACAGCTTGTTGTAAACA 3′扩增pMD18-T-PMI 质粒，将PCR产物连入pMD19-T simple 质粒，得到pMD19-T simple-PMI质粒。用XhoI同时酶切pMD