ERKFoxO3a信号轴在牡荆脂素VB1抑制肝癌HepG2细胞系增殖中作用.docVIP

ERKFoxO3a信号轴在牡荆脂素VB1抑制肝癌HepG2细胞系增殖中作用 　　[摘要] 目的：探讨ERK/FoxO3a信号轴是否介导牡荆脂素（VB-1）对人肝癌HepG2细胞系增殖的抑制作用。方法：MTT法观察不同浓度VB-1对人肝癌HepG2细胞系和永生化人胚肝L-02细胞系增殖的影响，集落形成法检测细胞生长，Western blot检测ERK1/2，FoxO3a蛋白磷酸化水平。结果：VB-1以浓度依赖方式抑制HepG2细胞增殖活性，对L-02细胞作用微弱。VB-1有效抑制HepG2细胞锚定依赖生长，并降低p-ERK1/2，p-FoxO3a表达水平，呈浓度依赖性。MEK抑制剂PD98059增强VB-1抑制HepG2细胞增殖和ERK1/2，FoxO3a磷酸化的作用。结论：VB-1通过阻断ERK/FoxO3a信号轴抑制肝癌HepG2细胞增殖活性。 　　[关键词] 肝癌；牡荆脂素；VB-1；ERK1/2；FoxO3a 　　肝癌是位居世界第五位的常见实体肿瘤，病死率位居第三位。肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的80%～90%，预后差，死亡率高[1-2]。HCC 最有效的根治方法为手术切除，但多数患者确诊时已属中晚期。手术术后复发也是需面对的严峻问题，因此药物治疗对肝癌不可或缺。化疗药物会对患者产生毒副作用，且易发生多药耐药。因此研究天然植物抗肿瘤有效成分，开发新型低毒副作用、有效的抗肝癌药物具有重要意义。作者前期研究证实来自黄荆子的乙酸乙酯提取物Evn-50具有广谱抗肿瘤活性，以新木脂素类的牡荆脂素化合物VB-1含量最高并具较强的抗肿瘤活性[3]，据报道其对包括肝癌细胞在内的多种肿瘤细胞具有细胞毒性作用[3-5]，但作用机制尚不清楚，本研究旨在探讨VB-1是否通过调控ERK/FoxO3a信号通路抑制人肝癌HepG2细胞系细胞增殖活性，为VB-1应用于防治肝癌提供实验依据。 　　1材料和方法 　　1.1药品和试剂 人肝癌HepG2细胞系和人胚肝L-02细胞系购自中国典型物培养保藏中心；黄荆子木脂类化合物VB-1[6-羟基-4-（4-羟基-3-甲氧基苯基）3-羟甲基-5-甲氧基-3，4-二氢（3R，4S）-2-醛基萘]由中南大学药学院天然化合物系提供；抗ERK1/2，p-ERK1/2，FoxO3a，p-FoxO3a，β-actin抗体购自美国Cell Signaling公司；DMSO，胰蛋白酶，MTT，5-FU购自美国Sigma公司。 　　1.2细胞培养和处理 细胞常规培养用DMEM培养基置37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞实验，实验组细胞分别采用含2.5，5.0，10.0 μmol·L-1 VB-1的培养基培养；溶媒对照组细胞采用含0.1%DMSO的培养基培养，在细胞毒性试验中，同时设置阳性对照孔5-FU 10.0 μmol·L-1。 　　1.3MTT测定 取对数生长期细胞，用无血清DMEM培养基调节细胞密度为以5 000个/孔，并接种于96孔细胞培养板中培养24 h。然后按照前述分组方法处理48 h，加入5 g·L-1 MTT溶液20 μL，继续培养4 h，吸除培养基，加入150 μL DMSO 溶解沉淀的紫蓝色晶体。用ELX-800 酶联免疫检测仪在570 nm波长测定吸光度A。设0.1%DMSO组细胞增殖活性为100%，计算相对细胞活力=A实验组/A对照组×100%。 　　1.4平皿集落形成试验 取24孔培养板，每处理组的培养体系为单细胞悬液，置37 ℃，5%CO2 24 h，后加入不同浓度VB-1处理，同时设置阳性对照孔5-FU 10.0 μmol·L-1，溶媒对照孔0.1%DMSO，每组3个复孔，48 h后，药物换成新鲜培养液，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液，当培养皿中出现肉眼可见细胞集落时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15 min，弃甲醇后空气干燥。用0.5%结晶紫染液染色10 min，流水缓慢洗去染液，空气干燥。以细胞数大于50个或直径大于75 μm为一个克隆，倒置显微镜下计数每孔克隆数。 　　1.5Western blot 分析 用或不用PD98059预处理30 min，不同浓度的VB-1处理24 h，裂解细胞。细胞裂解液的蛋白样品（50 μg总蛋白/泳道）经10%SDS电泳分离后转移至PVDF膜。分别加入一抗于37 ℃孵育过夜；PBS-T洗膜15 min，4次。辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗与膜孵育1 h，PBS-T洗膜15 min，4次。用增强型化学发光剂检测印迹蛋白。X线胶片扫描后，用图像分析软件（AlphaimagerTM 2200）分析。 　　1.6统计学处理 实验数据以±s表示，采用SPSS 16.0统计学软件处