N―乙酰半胱氨酸对肺微血管内皮细胞核因子κB活性影响体外研究.docVIP

N―乙酰半胱氨酸对肺微血管内皮细胞核因子κB活性影响体外研究 　　1.北京军区总医院急诊科，北京　100700；2.北京军区总医院干一科，北京　100700；3.广州军区广州总医院ICU， 　　广东广州　510010；4.北京军区司令部门诊部，北京　100041；5.解放军66011部队卫生队，北京　102600 　　[摘要]　目的　探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）对人肺微血管内皮细胞（HPMEC）核因子κB（NF-κB）结合活性和环氧合酶-2（COX-2）表达的影响机制。　方法　体外培养HPMEC细胞株，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）检测NAC对HPMEC增殖活化的抑制作用，分别采用NAC（1　mmol/L）处理1　h，肿瘤坏死因子α（TNF-α）（100　ng/mL）处理1　h，NAC+TNF-α联合处理。凝胶电泳移动抑制实验检测HPMEC　NF-κB的结合活性；免疫蛋白质印迹检测相应的HPMEC胞质内NF-κB抑制蛋白（IκB-α）的表达；免疫细胞化学观察HPMEC　NF-κB表达的核内转移；激光共聚焦检测NAC对HPMEC中COX-2表达的影响。　结果　NAC对HPMEC的增殖活化有明显抑制作用，NAC+TNF-α联合处理组吸光度值明显低于TNF-α处理组，差异均有统计学意义（均P　　0.05）。　结论　NAC　可抑制HPMEC增殖活化；NAC可抑制HPMEC　NF-κB结合活性、减少核内转移发生和COX-2的表达。 　　[关键词]　N-乙酰半胱氨酸；核因子κB；人肺微血管内皮细胞 　　[中图分类号]　R563　[文献标识码]　A　[文章编号]　1673-7210（2012）12（c）-0018-04 　　近年来研究发现，氧化应激反应可导致或加重脓毒症、组织器官纤维化等一系列疾病[1]。因此，抗氧化剂在重症感染性疾病等防治作用日益受到重视[2-3]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）为巯基化合物供给体，具有抗氧化损伤、清除氧自由基、抗炎、调节细胞代谢等作用，可降低脓毒症、多器官障碍综合征等病死率[4-5]。目前NAC对严重感染性疾病的保护作用还不明确，关于NAC对人肺微血管内皮细胞（HPMEC）核因子κB（NF-κB）的活性影响研究很少。本研究通过应用NAC和肿瘤坏死因子α（TNF-α）对HPMEC进行干预，观察NAC对HPMEC　NF-κB结合活性和环氧合酶（COX-2）表达的影响，初步探讨其在炎性疾病防治中的可能机制。 　　1　材料与方法 　　1.1　材料 　　HPMEC细胞株（购自Clonetics公司）；高糖型DMEM培养基（购自美国GIBCO公司）；细胞培养板和培养瓶（购自美国Corning公司）；抗COX-2（购自美国Santa公司）；NF-κB、核因子抑制蛋白（IκBα）多抗（购自美国Sigma公司）；核蛋白提取试剂盒（购自美国Pierce公司）；NAC（购自美国Sigma公司）；TNF-α（购自美国Sigma公司）；ECL化学发光试剂盒（购自美国Pierce公司）；[α-32P]dATP（购自北京拜尔迪生物技术有限公司）；激光扫描共聚焦显微镜（德国Leica公司）。 　　1.2　方法 　　1.2.1　HPMEC的培养　含10%小牛血清、100　U/mL青霉素、100　μg/mL链霉素的DMEM培养基中37℃、5%　CO2条件下培养HPMEC。 　　1.2.2　四甲基偶氮唑盐（MTT）检测NAC对HPMEC增殖活化的抑制作用　细胞在含10%小牛血清DMEM培养基中生长至对数生长期时，更换为无小牛血清DMEM培养基继续生长24　h，培养的HPMEC细胞处于细胞周期G0期后分别予以NAC处理24　h（其终浓度分别为100、10、1　mmol/L）；TNF-α（100　ng/mL）处理24　h；NAC（10　mmol/L）、TNF-α（10　ng/mL）联合处理24　h。接种于96孔板内，每组设6孔，每孔加入150　μL　DMSO，置摇床上低速振荡10　min，使结晶物充分溶解。MTT法在酶联免疫检测仪上490　nm处测量各孔吸光度值（A值）。而正常对照组继续在含10%小牛血清DMEM培养基中生长相同时间，同时设置调零孔、空白对照孔。 　　1.2.3　凝胶电泳移动抑制实验（EMSA）检测HPMEC　NF-κB的结合活性　参照文献并略修改。①胞质蛋白和核蛋白提取：HPMEC细胞分别予NAC（1　mmol/L）处理1　h；TNF-α（100　ng/mL）处理1　h；NAC和TNF-α联合处理（先予NAC预处理1　h，再予TNF-α处理1　h）。取约1.0×107/mL的HPMEC细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，收集细胞；加入1×Hypotonic　buffer重悬