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SSR分子标记技术在种子纯度检测中应用 　　摘要 概述了SSR分子标记原理和特点，阐述了SSR分子标记鉴定杂交水稻种子纯度技术要点，对其应用前景进行了展望，以期为该技术在种子纯度检测中的应用提供参考。 　　关键词 SSR分子标记；种子；纯度检测；应用 　　中图分类号 S339.31 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）13-0049-01 　　Abstract This paper summarized principle and characteristics of SSR molecular marker，introduced technical points of hybrid rice seed purity identification by SSR molecular marker，and its application prospect was prospected，in order to provide reference for application of seed purity test. 　　Key words SSR molecular marker；seed；purity test；application 　　?N子纯度是评价种子质量的主要指标。在杂交水稻生产中，由于忽视种子真实性和品种纯度检验，伪劣掺假种子伤农事件时有发生，给农业生产造成了不可弥补的损失。因此，对杂交种子纯度进行快速、准确、有效的鉴定显得十分重要。 　　SSR标记由于具有重复性好、遗传上呈共显性、数量丰富、多态性高、引物序列易交流、结果稳定可靠等优点，已成为杂交水稻种子纯度鉴定的一种理想分子标记方法。 　　1 SSR分子标记原理 　　SSR即简单序列重复，不同水稻品种基因组DNA中，存在着能够稳定遗传的简单重复序列（SSR）重复次数的差异，这种差异可以通过从水稻种子、幼苗等组织中提取DNA，用SSR引物进行扩增，经电泳获得DNA指纹图谱加以区别。利用这一原理，农业部发布了水稻品种真实性鉴定标准，即《水稻品种鉴定――指纹分析方法》（2007年），利用该原理和SSR标记技术，在分子水平上鉴定品种纯度也成为必然的发展趋势[1-3]。 　　SSR分子标记技术用于杂交水稻种子纯度鉴定，是基于F1杂交种子（父母本杂交后代）具有父母本共同的遗传基础，而父母本之间又在特定的SSR位点存在多态性，通过筛选引物对样品DNA进行PCR扩增，凝胶电泳后观察不同DNA谱带类型，F1具有双亲互补的带型，很容易将杂交组合与其亲本及其他混杂种子分辨开来（图1）。 　　2 SSR分子标记鉴定杂交水稻种子纯度技术要点 　　2.1 DNA提取 　　多数研究者以新鲜叶片或发芽幼苗为材料来提取样品中DNA，提取的DNA质量应符合PCR扩增的要求，常见的DNA提取方法主要有以下几种：CTAB提取法、SDS提取法、磁珠提取法、碱煮法。CTAB提取法：DNA质量高、得率高，储存时间长，成本低，但程序复杂；SDS提取法：DNA质量高，储存时间长，程序较复杂；磁珠提取法：DNA质量高、得率较低，储存时间长，程序较简单；碱煮法：质量较低，存储时间短、程序简单，成本极低[4-6]。 　　2.2 PCR扩增 　　2.2.1 引物筛选。引物筛选原则：一是杂合率高、具有双亲共显性；二是多态性高、区分异品种能力强；三是综合考虑多重电泳组合潜力、碱基基序重复、扩增效果好（特异性扩增强、非特异性扩增少、引物扩增稳定、重复性好）。 　　2.2.2 PCR扩增反应体系。通常PCR扩增在10 μL反应体积下进行，包含DNA聚合酶0.2 U、SSR标记引物1 μmol、模板DNA 2～10 ng、dNTP 1 μmol、10倍PCR反应液（含MgCl2）1 μL，其中选用的引物为在父母本间具有差异性的引物。 　　2.2.3 PCR扩增反应程序。94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s（不同引物退火温度有别），72 ℃延伸30 s，共进行32个循环，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存，经过32个循环后，单个SSR位点特定片段可得到几百万倍的扩增，从而可在凝胶上显现出来。 　　2.3 PCR扩增产物检测 　　目前，应用于SSR扩增产物检测的方法主要有温度扫描凝胶电泳、DNA测序、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、普通琼脂糖凝胶电泳、phor琼脂糖凝胶电泳等[7-9]。 　　2.4 数据记录与统计 　　检测纯度的几对引物分别读出结果，标出含有父本多少粒、母本多少粒、杂株多少粒，再用总的供检粒数减去异品种粒数，再除以总的供检粒数，得出的结果进行综合分析，推荐使用其中最小值作为纯度鉴定的结果[10-14]。