PC12细胞的培养整理总结.docVIP

PC12细胞的培养整理总结 一、PC12细胞的折光性本来就比较好，刚传代以及新分裂的细胞都是亮的，至于你说的贴壁的细胞，不知道是否是圆的，在牛血清的刺激下，特别是国产的，会使pc12细胞发生定向的分化，长突起，贴壁就比较牢。 PC12分为未分化的和分化的.前者是球状,成团生长;后者形成很多丝状体;而丁香园里有人说楼主的这种细胞严格来讲已经不能算是PC12了. 前几天为自己养的PC12是未分化还是分化型困扰,查了一些资料,现发上来希望能给有同样问题的战友有一点帮助! 培养条件:ＰＣ12细胞培养于铺有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中,置于ＣＯ2培养箱(37℃,95%空气5%ＣＯ2),培养基选用ＤＭＥＭ(ｐＨ7.4,高糖),加入10%灭活小牛血清及5%灭活马血清。 分化前:ＰＣ12细胞在培养基中多呈圆形,直径15～20μｍ,也有椭圆或多角形的,扁平的细胞少见,倾向于聚集成小团簇状(A图)。 分化后:加入ＮＧＦ后的24ｈ内细胞停止分裂,长出似交感神经元样的突起;第4～14ｄ,细胞体积增大,突起增多并增长,形成网络,数周后,突起可长达500～1000μｍ(B图)。 NGF可促进PC12细胞向类似交感神经元样的形态分化,最终导致PC12细胞在生理、生化方面都具有神经元样的功能[12]。分化后的 PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍 有的战友提到分化的PC12药敏性更好是不是因为分化后的 PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍 二、我养这个细胞一年多了，有点经验和大家交流一下。 1.我用的是15％的马血清和2.5%的胎牛，胎牛要用进口的，国产的容易分化。 2.关于表面处理的问题，值得注意的是胶原和多聚赖氨酸使细胞贴壁的原理不太一样。多聚就是纯粹的物理黏附作用，而胶原则是刺激的细胞，使细胞的表达一些能有助于贴壁的蛋白，这种刺激作用还涉及到MAPK途径，所以如果做细胞信号转导的战友要注意到这点。相关的文献可以自己到pubmed上查找。 3.完全分化的细胞不能传代，因为贴壁已经很牢固，强迫其脱离可能造成，尤其是细胞的突起断裂，细胞存活率很低。 4.用NGF刺激的24－48h后，细胞可以消化下来传代或者冻存，用于继续培养。一般这种细胞叫做NGF activated cells。用于检测待测物的NGF样活性，指标是细胞突起的程度。 5.楼上有照片贴出来细胞呈现梭形，严格讲这种细胞已经不能叫做PC12了。严肃的话最好放弃。 6.该细胞容易聚集生长，传代种到新瓶子之前最好充分吹打，把细胞弄匀，否则传的细胞也呈现聚集的团，很难看。我的经验是消化液用EDTA加比较稀的胰酶，这样消化的细胞比较容易成单细胞悬液。 三、我目前已经养PC12一个多月了，经验谈不上很多，不过失败的教训倒是不少，可以拿出来和大家分享一下 1.细胞的培养基，我开始用10％FBS国产四季清的，DMEM，没加马血清和多聚赖氨酸什么的，因为条件关系，结果细胞贴壁性很好，生长速度还可以，3天1：2传代，在传到第5代时候，观察细胞状态下降，正常对照组也开始出现调亡，后查文献发现血清用多了，分析其内含有大量刺激生长物质，导致细胞出现分化，状态不稳定，目前改用5％FBS，DMEM，细胞生长速度明显放慢，现5天1：2传代，这和ATCC上PC12的倍增时间92小时比较接近。 2.传代时候的细胞密度，有人说传代时候细胞过密，可能导致细胞分化，但是我在细胞仅50～60％传代，细胞死亡率很高，因此目前改用80％传代，还算稳定，确实有分化的迹象，如，细胞出现多角形等，但属轻度，和楼主说的差不多，可能和我用国内血清有关。 3.胰酶对PC12无效。我个人提出胰酶消化PC12是个错误观点，其一针对悬浮PC12，胰酶消化的效果不好证实，其二，我养的PC12，性质贴壁，用100％胰酶消化1小时，愣是没动静，细胞甚至不变圆。最后用力拍打才可以，但代价是细胞损伤非常大，不好恢复。其三，ATCC上明确建议用细胞刮勺刮取PC12，目前我改用刮勺，细胞传代后状态要比用胰酶消化的好很多。 4.再者关于1640和DMEM的问题，我个人观点，二者的主要区别在于DMEM含糖量高，神经细胞都喜欢这，另外1640含一些离子，是防止培养的细胞贴壁。1640一开始主要应用于单克隆抗体的制备，其后因其比较适合国内特点，比如价廉物美啊，所以目前在很多细胞上都有应用，ATCC上建议用1640，更多的原因是防止贴壁，诱导分化。不过，2种培养基我都试过，好像在国产5％血清的条件下，1640培养基不能改变PC12性状。所以我采用DMEM，能量高啊。 5.因此我个人认为，5％的FBS，DMEM，足够PC12生长需要，4天左右1：2传代，可以不用贴壁处理（国产血清诱导轻度分化），如要求严格未分化，请参照ATCC推荐。 四、ATCC上明确说PC12倍增时间为48小时。