TMV和CMV病毒外壳蛋白基因双靶向RNA干涉载体构建.docVIP

TMV和CMV病毒外壳蛋白基因双靶向RNA干涉载体构建 　　摘要：依据RNA干扰机制构建多病毒基因靶向的RNA干涉双元载体系统，为培育抗病毒复合侵染的番茄品种提供遗传转化载体。以烟草病毒病（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）病毒外壳蛋白基因作为RNA干扰靶标基因，针对病毒株系间外壳蛋白基因同源区域设计靶序列引物，经RT-PCR获得两段靶标基因的DNA靶序列。借助T载体将两段靶序列连接成一条DNA序列。酶切后正向、反向锚定连接到pUCCRNAi中间载体的克隆位点，形成靶序列在载体中的双向重复结构；重复结构酶切后插入含超强启动子的pC2300-35s-OCS表达载体，重组的表达载体质粒电击转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中，完成RNAi双元载体系统的构建。 　　关键词：烟草病毒病（TMV）；黄瓜花叶病毒（CMV）；番茄；RNA干涉；载体构建 　　中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）03-0759-05 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.054 　　Construction of RNA Interference Vectoer in TWO-Gene-Targeted of TMV and CMV 　　YIN Lei，TANG Kai-yue，ZHANG Yue-xin，LI You，LV Feng-xia 　　（College of Life Science and Technology， Mudanjiang Normal University， Mudanjiang 157012，Heilongjiang， China） 　　Abstract： On the basis of the RNA interference-mechanism，RNAi binary-vector system targeting virus gene was constructed， offering genetic transformation vector to tomato disease-resistance breeding. The coat protein gene of TMV and CMV was regarded as target-gene for RNA interference， designing the primers sequence according to the-homologous region of virus coat protein gene， cloning two sequences of TMV and CMV through RT-PCR and connecting into a sequence by T-vector. After enzyme digestion， bidirectional inserted into cloning sites of pUCCRNAi middle vector. After enzyme digestion， the repetitive structure inserted into pC2300-35s-OCS expression vector which containing super promoter. The recombinant expression vector plasmid electroporating into the Agrobacterium which containing the helper-plasmid. The binary vector system for RNAi has been constructed. 　　Key words： tobacco mosaic virus； cucumber mosaic virus； tomato；RNA interference； vectoer construction 　　番茄病毒病是由多种病毒单独或复合侵染引起的病害[1]，以烟草病毒病（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）为主要病源。病原物随病残体在土壤、种子中或其他宿根植物上越冬，生长阶段通过蚜虫、田间操作造成的伤口传病。番茄病毒病是番茄上发生最普遍、最难防治、为害最严重的病害之一，一般减产20%～30%，影响番茄果实的食用价值，严重时甚至造成绝收[2]。目前，生产栽培中防治番茄病毒病常采取的方法有选育抗病毒番茄品种、接种弱毒株系诱导抗性、完善栽培技术、隔离传毒蚜虫等方法[3]。但抗病毒品种面对品种繁多且随时突变的病毒存在抗性丧失的可能，其他措施属规避病害发生，难以持久、有效地抵抗病毒侵染，