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TNF―α,INF―γ诊断意义 　　摘要：目的 为更好地为儿童急性再生障碍性贫血体内细胞因子浓度变化提供证据。方法 采再障组（46例）和对照组（48例）静脉血，用酶联免疫吸附法测定所取血样标本中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（INF-γ）的含量。并用独立样本t检验分析两组外周血中细胞因子是否存在显著性差异。结果 再障组患儿外周血TNF-α和INF-γ的含量均高于对照组儿童。结论 通过对TNF-α和INF-γ的监测，可以有效的了解再障患儿疾病进展，治疗效果和预后情况。 　　关键词：再生障碍性贫血；肿瘤坏死因子-α；干扰素-γ 　　再生障碍性贫血可分为急性再障和慢性再障两型。其中急性再生障碍性贫血发病急、进展快，骨髓衰竭是其主要病理过程，常伴内脏出血、严重感染，常危及生命，预后不良。但是现在大部分的病例被诊断为特发性免疫异常导致的再生障碍性[1]。细胞因子失调，包括肿瘤坏死因子（TNF-α），干扰素（INF-γ），今年来研究发现在再生障碍性贫血的发病机制中起到了重要的作用[2]。儿童再生障碍性贫血已经成为继儿童白血病之后，儿童死亡率较高的一种血液系统疾病[3]。本研究为了给临床上提供更好的关于儿童急性再障体内细胞因子浓度变化的证据。现报告如下： 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 2010年6月～2013年6月我院诊治的46名急性再生障碍性贫血患儿。符合我国小儿再生障碍性贫血的诊断及分型标准[4]。患儿均为急性再生障碍性贫血发作。其中男20例，女26例，中位年龄6.3（2～14）岁。对照组选择同期到我院体检中心体检的正常儿童，共48例，男21例，女27例，中位年龄7（2～16）岁。两组儿童的年龄比较和性别比例上无显著性差异，P≥0.05。 　　1.2方法 　　1.2.1标本收集 用肝素钠抗凝管采集静脉血5ml用于TNF-α测定。取用无肝素采集管采集静脉血15ml用于INF-γ测定。 　　1.2.2TNF-α含量的测定 以鼠源性的抗TNF-α单抗以每孔400ng的量，在PH值为9的碳酸-碳酸钠缓冲液中包被96孔板中，置4℃环境过夜。取出后洗涤3次，加入预先备好的待测样本及标准的TNF-α（制作标准曲线用）。37℃孵育2h。用洗涤液洗涤3次，加入羊抗鼠TNF-α抗体，37℃孵育2h后，再洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG，37℃孵育2h后加入底物显色。终止显色后在自动酶标仪上测定浓度，并以标准曲线为基准求得TNF-α的含量。以（x±s）ng/ml的形式表示结果。 　　1.2.3INF-γ含量测定 将上述采得的用于INF-γ测定的静脉血在室温凝固30m in，1000r /m in离心15m in，收集血清。检测IFN-α用人IFN-α检测Elisa试剂盒，操作步骤为分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。再用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。终止显色后在自动酶标仪上测定浓度，并以标准曲线为基准求得IFN-α的含量。以（x±s）ng/ml的形式表示结果。 　　1.2.4统计学方法 应用SPSS1 12.0统计学软件进行统计学分析，计量资料采用均x ± s表示，结果分析采用独立样本的t 检验，以P 0.05 为差异有显著性。 　　2 结果 　　2.1 TNF-α含量的对比结果 再障组患儿外周血中TNF-α含量的平均值是：（56.51±20.02） ng/ml，而对照组的患儿的平均值为（25.88±10.11）ng/ml。通过独立样本t检验分析，P=0.0080.05，差异具有显著性。 　　2.2 INF-γ含量的对比结果 再障组患儿外周血中INF-γ含量的平均值是：（21.2±9.22） ng/ml，而对照组的患儿的平均值为（8.87±10.11）ng/ml。通过独立样本t检验分析，P=0.0010.05。 　　3 讨论 　　近年来，越来越多的证据表明，再生障碍性贫血发病与