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α―淀粉酶对类黄酮抗氧化活性影响 　　类黄酮的化学结构及其取代基的位置基本决定了它们的抗氧化效果。目前广泛认为，B环是类黄酮抗氧化能力、清除自由基的重要活性部位，一般情况下，B环上羟基基团越多，其生物活性就越强。而羟基基团的糖苷化和2、3位双键氢化都容易引起类黄酮生物活性的降低。 　　该文通过采用氧自由基清除能力（oxygen radicalabsorbance capacity，ORAC）评价法、DDPH自由基清除法、抗亚油酸氧化法、还原能力法四种不同的抗氧化活性评价方法，旨在测定类黄酮在加入PPA溶液前后，类黄酮抗氧化能力的变化情况。 　　材料与仪器 　　PPA购自于Sigma公司；类黄酮（木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素）购自陕西慧科植物开发有限公司，纯度达98%；荧光素钠，维生素E水溶性类似物Trolox，2，2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2，2’-Azobis（2-methylp ropionamidine）dihyd rochIo ride，AAPH），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DDPH），亚油酸均购自于Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯，所有溶液均用等离子水配制，并用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer saline，PBS）以保持pH6.8±0.02的生理条件。 　　全波长扫描式多功能酶标仪，紫外可见分光光度计数显，恒温水浴锅，pH值精度计，超声细胞粉碎器，数控超声波清洗器 　　试验方法 　　PPA对类黄酮ORAC体系抗氧化能力的影响。称取1mg类黄酮（木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素）溶于2mL二甲基亚砜，得到0.5mg/mL的类黄酮储备液。取10μL类黄酮储备液与9901JLPPA液（溶于pH7.4的PBS缓冲液，0.328U/mL）、990mLpH7.4的PBS缓冲液，混匀于37℃反应30min，分别得到1mL两组样液并加以标记为样液1和样液2。同时，将类黄酮储备液换成等体积的二甲基亚砜作同样处理，作为对照以排除二甲基亚砜对整个试验结果的影响。 　　在96微孔平板中依次加入20μL上述两种样液、对照液和五种不同浓度的Trolox标准溶液，板的边缘孔均加入等体积的pH7.4的PBS缓冲液；然后每孔加入200pL的已配置好的荧光素钠盐溶液（现配现用），再运用Wallace1420Manager软件设定测定程序，自动混匀，在37℃条件下预热20min；待96孔平板出机后，迅速加入20μLAAPH（现配现用），自动混匀，仪器开始自动测定。在激发波长485nm，吸收波长535nm条件下，每隔2min记录一次荧光强度值，每次纪录前自动震荡混匀8s，共测定60个循环，荧光强度分别记录为f1，f2，f3，……，f60；利用相应软件计算AUC值，再计算ORAC值。则PPA对类黄酮ORAC体系抗氧化能力的抑制率算术公式如下： 　　PPA对类黄酮清除DDPH自由基的影响。准确称取20mgDDPH粉末，用无水乙醇溶解并定容至250mL，得到摩尔浓度为2×10-4mol儿的DDPH乙醇混合液，现配现用。 　　将类黄酮（木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素）溶于无水乙醇，得到20，40，60，80，100μg/mL不同浓度的类黄酮溶液。取50HL上述不同浓度的类黄酮溶液与0.2mLPPA液（溶于pH6.8的PBS缓冲液，0.328U/mL）混合并于37℃水浴30min，再加入3mL的2×10-4mol/L的DDPH乙醇混合液，混匀后，在黑暗处室温条件下静置30min。用无水乙醇作为参比液，在517nm处测定样品的吸光值。对照组为将PPA液换成等量的PBS缓冲液；空白组为将黄酮液换成等量的无水乙醇，平行测定三次。则通过拟合曲线可得类黄酮加入PPA溶解液前后的半抑制浓度UC50值，以及PPA对黄酮抗亚油酸氧化的抑制率的算术公式如下： 　　PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的影响。称取亚油酸0.6g，吐温-20 0.5g溶于150mL pH 6.8 0.2mol儿的PBS缓冲液中，在超声细胞粉碎器下工作20min，得到均一体系的混合液。 　　将0.2mL0.1mg/mL的黄酮液（溶于二甲基亚砜），不同酶活力的PPA液先混合37℃水浴30min，再加入上述混合液2.5mL，5mL20mMAAPH反应液混合均匀于反应器中恒温水浴70min。 　　取出上述反应液0.1mL于具塞试管中，加入4.7mL乙醇（75%），0.1mL硫氰酸铵（30%）和0.1mLFeCl2