H7亚型禽流感病毒HA基因原核表达及表达产物反应原性分析.docVIP

H7亚型禽流感病毒HA基因原核表达及表达产物反应原性分析 　　摘要：为构建新型H7亚型禽流感HA基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。从NCBI数据库下载H7亚型禽流感HA全基因序列，合成HA基因；定向克隆到原核表达载体pET-32a（+）的多克隆位点中，构建重组原核表达质粒pET-32a（+）-HA；转化入大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，表达产物经SDS和Western-blot法鉴定。结果显示，重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确；重组的HA融合蛋白约为84 ku，大小与预期融合蛋白大小一致；重组HA融合蛋白可以与His标签单克隆抗体特异性结合，与H7阳性血清有较强的反应原性。成功构建了HA基因原核表达载体，并在大肠杆菌BL21（DE3）中获得重组HA融合蛋白表达。 　　关键词：H7N9禽流感病毒；HA基因；pET32a（+）；原核表达；反应原性分析 　　中图分类号： S852.65文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）10-0049-04 　　收稿日期：2015-09-01 　　基金项目：江苏省句容市科委项目（编号：NY2013029）；江苏省镇江市农业科技支撑项目（编号：SBK2014022021）；南京农业大学教改项目（编号：2013Y021）；南京农业大学动物医学院教育教学改革研究项目；江苏高校优势学科建设工程资助项目。 　　作者简介：董斌（1990―），男，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向为预防兽医学。E-mail：1135220155@。 　　通信作者：许家荣，教授，硕士生导师，主要从事学兽医流行病学研究、畜禽传染病防治、生物制品研制。E-mail：xjr@。[HJ] 　　[ZK）] 　　H7N9型禽流感病毒感染人事件于2013年3月底在华东地区（上海和安徽2地）率先发生，感染以迅速进展的肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和致死性转归为特点[1]。目前，已经在鸡、鸽子中检测到H7N9型禽流感病毒，但这些家禽不表现明显的临床症状。陈化兰团队在《科学通报》的最新研究显示，近期在我国导致人感染的新型H7N9流感病毒与同一时期存在于活禽市场上的H7N9流感病毒高度同源；该新型H7N9流感病毒是不同来源病毒的重组病毒，它的6个内部基因来源于H9N2禽流感病毒，HA基因来源于浙江鸭H7N3，NA基因来自韩国野生鸟类携带的H7N9；H7N9病毒的受体结合位点获得了部分人流感病毒特征的突变，病毒再感染人后获得了关键氨基酸位点的适应性突变，这可能与该病毒对人的感染和致死能力有关[2]。尚未证实此类病毒是否具有人传染人的特性，但已有家族式感染的报道[3]，到目前已有数名患者抢救无效死亡。 　　禽流感病毒在生物分类学上属正黏病毒科（Orthomyxoviridae）A型流感病毒属（Influenzavirus A）[4-5]。A型流感病毒基因组为8个节段的单股负链RNA，编码11种功能蛋白。病毒基因组分节段的特性使流感病毒容易发生基因重排。A型流感病毒呈多形性，多为球形，然而新分离的主要为丝状。病毒直径80～120 nm。病毒粒子结构的最外层为来自于宿主细胞的双层类脂囊膜。囊膜上有3种蛋白突起（又称纤突）：血凝素（hemagglutinin，HA）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）和基质蛋白2（matrixprotein，M2），这3种突起均以疏水性氨基酸锚定在类脂膜上。中间层为基质蛋白1（M1）。最里层是呈螺旋型对称的核衣壳，含有核蛋白（neucleoprotein，NP）、3种多聚蛋白酶和病毒基因组RNA[6]。迄今为止，已知A型流感病毒的HA有16个亚型（H1-H16）[7]，NA有9个亚型（N1-N10），HA和NA之间的不同组合使A型流感病毒有许多亚型（如H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等），各亚型之间无交互免疫力。其中高致病性的主要有H7和H5亚型。在A型流感病毒的8个RNA节段中，节段4编码血凝素HA。HA属于Ⅰ型膜糖蛋白，是流感病毒最重要的表面蛋白。新合成的HA在粗面内质网中进行糖基化，并在通过内质网时切除氨基端含14～18个氨基酸的信号肽。HA以同源三聚体的形式突出在囊膜表面，呈棒状，由球形的头部和颈部组成，其中球部在HA1亚单位内，包括受体结合位点和大部分的抗原位点；颈部由全部HA2和部分HA1亚单位组成。HA 是流感病毒的主要表面抗原，能诱导机体产生保护性中和抗体[8-11]。流感病毒感染后产生能针对病毒HA、NA、M和NP蛋白的抗体，但只有针对HA顶部球形区的抗体能阻止病毒吸附到宿主细胞受体上[12]，从而中和病毒的感染力。这些抗体可以通过病毒中和试验或HI试验测定。 　　检测鸡血清样品中H7亚型抗体