RNA干扰下调CD98hc表达对胶质瘤细胞U251增殖转移影响.docVIP

RNA干扰下调CD98hc表达对胶质瘤细胞U251增殖转移影响 　　[摘要] 目的 观察下调CD98hc对胶质瘤U251细胞体外增殖、迁移及侵袭的影响。 方法 应用siRNA技术干涉U251胶质瘤细胞CD98hc的表达，筛选并获得CD98hc低表达的U251细胞株（U251KD）及阴性对照细胞（U251NC）。流式细胞技术及Western blot鉴定CD98hc的表达下调情况。应用CCK-8细胞增殖实验检测两组细胞增殖；细胞划痕实验及Transwell小室分别检测两组细胞的迁移及侵袭能力；Western blot检测MMP-2、MMP-9的表达。 结果 与阴性对照U251NC组相比，U251KD细胞中CD98hc水平明显下调（P 0.01），U251KD细胞的增殖和迁移、侵袭能力均显著受抑（P 0.05），MMP-2、MMP-9的表达也明显降低（P 0.01）。 结论 下调CD98hc的表达能够明显抑制胶质瘤U251细胞的体外增殖、迁移及侵袭，其机制可能与MMP-2、MMP-9的下调相关。CD98hc分子可作为胶质瘤治疗的一个潜在靶点。 　　[关键词] CD98分子；胶质瘤；细胞增殖；细胞侵袭 　　[中图分类号] R730.23 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）06（b）-0016-05 　　神经胶质瘤是好发于成人的一种原发性中枢神经系统肿瘤，50%以上的胶质瘤具有分化程度低、侵袭性强、恶性程度高等特点，临床预后较差[1]。临床胶质瘤的治疗多采用手术并辅以放/化疗的综合治疗方式[2]，但患者的生存期仍然较短，效果并不理想[3-4]，这主要与胶质瘤复杂的发病机制密切相关。多项研究表明，神经胶质瘤的发生发展是一个涉及多基因、多阶段的过程，因此，阐明其发病的分子机制对胶质瘤的治疗具有重要的指导意义。 　　CD98分子是由CD98重链（CD98hc、4F2hc）与LAT-1、LAT-2等6种轻链中的一条组成的异源二聚体，在细胞氨基酸代谢转运方面发挥着重要的作用[5]。越来越多的研究发现，CD98hc在多种肿瘤细胞表面呈高表达，与肿瘤的发生发展关系密切[6]。在人脑胶质瘤中CD98hc的表达明显高于正常脑组织，并且其表达水平与胶质瘤的病理分级呈显著正相关[7]。但是CD98hc在胶质瘤发生发展中的具体作用机制目前尚未见报道。本文主要通过干涉CD98hc的表达，观察其对胶质瘤细胞系U251的增殖和运动能力的影响，并初步探讨其机制，旨在为胶质瘤的基因治疗提供一定的理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　U251细胞株购自中科院细胞库；DMEM（美国Hyclone）；小牛血清（四季青）；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒及CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所）；Transwell小室（Corning公司）；Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；鼠抗CD98单克隆抗体、鼠抗MMP-2抗体、兔抗MMP-9抗体（Abcam）；抗人β-actin小鼠单克隆抗（Santa Cruz）；羊抗鼠FITC（中杉公司）；二抗（Pierce公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 U251细胞培养于含10% FBS、2% L-谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱，适时更换培养基和传代。实验时选取处于对数生长期的细胞。 　　1.2.2 U251细胞转染 取对数生长期的U251细胞2×105接种于6孔板中，继续培养，待融合度达80%左右，按质粒（μg）∶脂质体（μL）=1∶2的比例转染CD98hc-siRNA、空白对照（control siRNA），具体操作按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行，分别获得CD98下调的U251KD细胞株和阴性对照U251NC细胞株。培养48 h后收集细胞进行Western blot和流式细胞技术鉴定，鉴定成功后用于后续实验。 　　1.2.3 Western blot检测 收集待检测细胞，RIPA裂解提取蛋白，BCA蛋白定量后进行10% SDS凝胶电泳，湿转至PVDF膜后，应用5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，PBST洗膜3次后加入二抗，室温孵育1 h后，洗膜3次，化学发光，采集图像。 　　1.2.4 流式细胞染色 收集转染后的U251细胞，制成细胞混悬液，浓度为1×106/mL，4%多聚甲醛固定20 min后，1%BSA室温封闭20 min，加入鼠抗CD98单抗室温孵育1 h，PBS洗3次后加入羊抗鼠FITC室温1 h，PBS漂洗后上机检测。 　　1.2.5 CCK-8检测细胞增殖 收集转染后的U251细胞，每孔1×104个细胞接种于96孔板中，于固定时