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RNA沉默及其在丝状真菌中研究进展 　　【摘 要】RNA沉默是由siRNA参与的特异性的抑制或消除目的基因表达的现象，普遍存在于各种生物中。本文介绍了RNA沉默的历史、机制以及影响RNA沉默效率的因素，并简述了丝状真菌中RNA沉默的研究进展。 　　【关键词】RNA沉默；RNAi；基因抑制；丝状真菌； 　　【文章编号】1004-7484（2014）07-4252-02 　　1 RNA沉默的研究历史 　　Fire等在研究秀丽新小杆线虫的一种肌肉相关蛋白时发现，若同时注射该蛋白的mRNA和相应的反义RNA后，线虫会发生抽搐，分别注射时则线虫无任何变化。这与他们研究的线虫肌肉相关蛋白缺失后的表现一致。使用与其他特定基因互补的siRNA进行实验，结果发现与其同源的mRNA不再表达，相应的蛋白质也不再产生，线虫出现相应基因缺失的表型。他们把这一现象称为RNA干涉（RNAi）[1]。其实在此以前，有文献报道类似实验现象。1990年，Jorgenson等人试图将查尔酮合成酶基因转入紫色牵牛花中以加深它的颜色，结果发现一些花颜色不但没有加深反而表现出杂色，有的甚至成为纯白色。后来发现这是因为转入的查尔酮合成酶的基因和牵牛花中正常的基因一起发生了沉默，因此他们把这种现象叫做共抑制[2]，表现为一种转录后基因沉默现象（PTGS），这是一种转基因诱导的基因沉默。随后的研究发现病毒侵染植物后同样会诱导产生PTGS，被称为病毒诱导的基因沉默。1995年，Guo Su等在用反义抑制的方法使果蝇中的pal-l基因失活的实验中意外发现用有义链也能使基因失活，此实验第一次证明了双链RNA能导致基因沉默[3]。 　　在丝状真菌中，最早是在粗糙脉胞菌发现此类现象。1992年，Romano等向粗糙脉胞菌中导入额外拷贝的类胡萝卜素基因时发现了类似的基因沉默现象，他们将此现象称为抑制（Quelling）[4]。 　　迄今为止已在植物、动物、真菌等多种生物中发现了类似的基因沉默现象，并且在各种模式生物中，如拟南芥、果蝇、斑马鱼、小鼠、粗糙脉胞菌等，对这些现象的机理深入研究，结果显示，在不同物种中发生的基因沉默现象在细节上虽然不同，但是都涉及dsRNA的参与，而且发现各物种中存在一些参与此过程的同源蛋白。这里将RNAi、Quilling和PTGS通称为“RNA沉默”。 　　2 作用机制 　　2.1 起始阶段 　　双链RNA通过外源导入、转基因或者病毒感染等方式进入细胞后，专一性的双链RNA内切酶的作用下，将双链RNA切割成约21～23nt的片段。切割后的片段在3’端形成2bp的粘性末端，形成大量的siRNA（分子，又被称为引导RNA。它们可以识别生物体内与之同源的靶mRNA的序列，启动RNAi反应。 　　2.2 效应阶段 　　siRNA中的一条链作为向导链，被装配到由多个蛋白质因子组成的RNAi机器中执行RNAi效应。其中Argonaute是RNAi机器的关键蛋白质成分，最小的RNAi机器仅含有一个Argonaute家族蛋白质和一条向导小RNA。 根据向导小RNA的性质及调控基因表达的机制，目前有三种RNAi效应模型：（1） 靶mRNA降解模型。在这一过程中，向导小RNA整合进入一个被称为RNA诱导沉默复合物的RNAi机器，通过碱基配对，向导RNA指导RISC结合到靶mRNA上，然后RISC 执行定点裁剪，导致靶mRNA降解和靶mRNA基因表达的沉默。这种方式在多种植物及少数动物miRNA介导的基因沉默中发现；（2） 靶mRNA翻译抑制模型。在翻译抑制过程中，执行RNAi效应的RNAi机器同样是RISC ，也是通过碱基配对，向导小RNA指导RISC 结合到靶mRNA的3’UTR，导致靶mRNA的翻译抑制。这种方式常见于哺乳动物miRNA介导的基因沉默；（3） 转录水平的沉默模型。在此模型中，RNAi效应由一个被称为RNA诱导基因转录起始沉默复合物（RITS）的RNAi机器行使。RITS通过介导组蛋白甲基化修饰和异染色质形成，抑制基因转录起始，从而在转录水平沉默基因表达。在植物中最早观察到这种沉默方式，后来在裂殖酵母和果蝇中得到证明。 　　2.3 倍增阶段 　　倍增阶段主要由RdRP（RNA-dependent RNA Polymerase）实现。siRNA可作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链，它在RNAi机器的作用下也被裂解成新生的siRNA。通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。 　　3 设计方法及影响因素 　　3.1 设计方法 　　从作用的机理可以看出，RNAi的启动必须有小分子RNA的存在才能实现。在实际应用中，首先要根据靶DNA设计出siRNA的序列，然后，可