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ISSR标记在中国野生葡萄分类中应用 　　摘要：利用ISSR标记对包含16个中国葡萄野生种及其近缘植物的8l份材料进行分类研究，从100条引物中筛选出13条带型清晰、重复性高、多态性好的引物用于ISSR扩增，共扩增出分子量在300―2000bp的185条带，其中多态性条带175条，多态百分率为94.6％。根据IssR扩增结果，利用NTSYSpc2.10e软件进行相似性系数分析，81份葡萄种质的遗传相似性系数为0.57―0.99。通过UPGMA进行聚类分析，在遗传相似系数为0.83处，79份真葡萄亚属材料聚成22类，聚类结果与传统的分类结果基本一致。同时，根据ISSR聚类结果，将供试材料毛葡萄1099确定为桑叶葡萄。对燕山葡萄0947是否为燕山葡萄提出质疑，并检测出供试的变叶葡萄材料不是一个纯种，而是存在种间的过渡类型。 　　关键字：中国野生葡萄；ISSR；遗传相似系数；分类 　　中图分类号：S663.1　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)03-406-07 　　 　　我国是葡萄属植物的重要原产地之一，也是世界葡萄属植物种质资源最丰富的国家，原产的葡萄属植物有38个种、1个亚种和7个变种，此外，尚不确定或有争议的疑问种或变种14个。不同研究者从形态学、孢粉学、解剖学和生物化学等方面对中国野生葡萄的分类进行了大量的研究，利用RAPD技术在葡萄属植物和葡萄品种的分类及亲缘关系上也有一些探索。由于葡萄属内种间性状的过渡类型和种内多型性现象比较常见，加之分类学者对种或变种等的分类标准意见不一，使得我国原生的葡萄属植物种类的具体数目尚无公认的定论。因此，可以利用分子生物学方法对其进行更为深入的研究。ISSR(Iflter Simple Sequence Repeat)标记是基于微卫星序列发展起来的一项技术，与RAPD、RFLP、AFLP、SSR等分子标记方法相比，该方法具有快捷、稳定、成本低、DNA用量少和安全性较高等优势，已在果树遗传学如品种鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性分析以及遗传图谱的构建等方面得到广泛应用。 　　我们应用ISSR分子标记技术，对包括东亚种群(16个中国葡萄野生种)、欧亚种、欧山杂种、美洲种群(沙地葡萄和河岸葡萄)和砧木品种华佳8号(华东葡萄×欧亚种)及其近缘植物在内的8l份葡萄种质进行研究，旨在探索利用ISSR标记在葡萄属植物分类上的可行性。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　材料来源于中国农业科学院郑州果树研究所国家果树种质郑州葡萄资源圃，其名称和编号见表1。 　　 　　1.2　方法 　　采用CTAB法从葡萄嫩叶中提取基因组DNA，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，使用BioPhotometer plus核酸定量仪(Eppendorf)检测基因组DNA的浓度和纯度，并将浓度稀释为30-50mg?L-1。ISSR引物参照文献，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。参照吴子龙等和Moreno等的试验方法，对ISSR-PCR扩增体系进行优化。在20μL的扩增体系中：Mg2+为2.5mmol?L-1，dNTPs为0.25mmol?L-1，引物为0.5μmol?L-1，Taq DNA聚合酶为2U，模板用量在30-50ng。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s、51.4-58.6℃退火1min、72℃延伸2min、35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。 　　PCR反应在T-professional G型PCR仪(Biometra)上进行。扩增产物在含0.5mg?L-1EB的TAE缓冲液中进行电泳，使用LMS-26E凝胶成像仪(UVP)进行观察统计。ISSR-PCR反应中所使用的dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶，均购于TaKaRa公司。 　　 　　1.3　数据统计分析 　　根据每条引物扩增产物在琼脂糖凝胶中迁移率的不同，对电泳结果进行统计，扩增阳性(有条带出现)赋值为1，扩增阴性(无条带出现)赋值为0，依据条带有无统计得到所有位点的二元矩阵，利用NTSYSpc2.10e软件进行相似性系数分析，并通过非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析。 　　 　　 　　 　　 　　2、结果与分析 　　 　　2.1　ISSR引物筛选 　　以毛葡萄、山葡萄和变叶葡萄为模板，对加拿大哥伦比亚大学(UBC)发表的100条引物序列进行初筛，筛选出条带较为清晰、多态性较高的66条引物。并对66条引物进行最佳退火温度的筛选(图1)，得到13条带型清晰、重复性高、多态性好的特异引物，见表2。结果表明，在ISSR-PCR扩增中利用样本差异进行引物初筛，并通过退火温度对初筛引物进行复筛可以快速有效的获得较为理想的引物。