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Kan早期快速筛选转基因甜瓜应用研究 　　摘要：利用Kan处理甜瓜种子、幼苗，选择不同品种、不同时期Kan临界浓度。对花粉管通道法转化的甜瓜种子进行早期筛选。结果表明，鲁薄1号甜瓜(薄皮)对Kan反应较乌克兰、雪里华甜瓜(厚皮)敏感，种子较幼苗敏感，子叶承受的Kan压力是种子的3～4倍。子叶涂抹法是较适宜的筛选方法。PCR及Southern杂交检测证明，Kan对大量转化甜瓜种子进行早期筛选是可行的。 　　关键词：转基因甜瓜　Kan　早期筛选　PCR 　　 　　蔬菜作物转基因研究已在国内外广泛开展。研究过程中为了便于选择转化植株，通常在构建基因表达载体时插入遗传标记基因，如Gus、cat、NPT－II、gfp、pat、荧光素酶基因、冠瘿碱合成酶基因及二氢叶酸还原酶基因等，其中NPT－II基因应用最为广泛。使用NPT－II基因转化植物。可以使植物细胞产生对卡那霉素(Kanamycin，以下简称Kan)等抗生素的较大抗性，植株能够正常生长。 　　利用花粉管通道法能够收获大量“转化”种子。单纯依靠实验室的分子检测耗资大、时间长。因此，迫切需要建立一种与花粉管转化相适应的早期筛选技术。目前。Kan已经应用于转基因棉花、小麦早期筛选及田间检测，大量分子证据验证了Kan检测的可靠性。由于植物自身对Kan敏感性不同，且同一植物的不同发育时期对Kan抗性也存在差异。因此，研究甜瓜对Kan处理的反应，选择有效I临界浓度，可为大量“转化”种子早期快速筛选提供依据，加快花粉管通道技术在甜瓜基因转化中的应用。 　　 　　1、材料与方法 　　 　　1.1试验材料 　　受体甜瓜：乌克兰(厚皮)、雪里华(网纹)、鲁薄1号(薄皮)3个高代低糖自交系及相应的花粉管通道法转化种子，由山东省农业科学院蔬菜研究所甜瓜课题组提供。供体质粒：携带Npt－II、Anti－MAI基因。由山东大学生命科学院赵双宜、于喜艳教授提供。Kan：硫酸阿米卡星注射液由齐鲁制药厂有限公司生产，产品批号0508171，20万单位/支。NPT－II引物由上海生工生物工程公司合成。 　　P1：5’－GGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGC－3’，P2：5’－TGCCGACCATCTGTTGTYTGCCC－3’。TaKaRaTaqTM、λEcoTl4 I购自TaKaRa公司。Southern分析DIG High Primer DNA Labeling and Dectection StarterKit II(Cat No.11585614910)购自Roche DiagnosticsGmbh。Germany。HybondTM－N+尼龙膜购自AmershanPhamacia公司。其他为常规分析纯试剂。 　　 　　1.2试验设计 　　1.2.1试验浓度种子：Kan质量浓度0～1500 mg/L，每100mg/L设置1个浓度梯度，0mg/L为对照(CK)。叶片：Kan质量浓度0～8000mg/L，每500mg/L设置1个浓度梯度，0mg/L为对照(CK)。 　　1.2.2处理方法涂抹法：毛笔在Kan液中浸透，均匀涂抹1片子叶、半片真叶正面：连续重复处理3次。浸润法：脱脂棉团成小球，在Kan液中浸透。摆在叶片正面，为防止棉球滑落，用透明胶固定，3d后拿掉。喷雾法：幼苗2叶1心时用小型喷雾器均匀向苗床喷雾，保证雾流细、匀。连续重复处理3次。 　　1.2.3调查方法挑选整齐饱满的普通甜瓜种子，每个材料每个浓度均为100粒。在Kan溶液中浸种，30℃恒温黑暗条件下催芽。3～4d后统计种子萌发及根系生长情况。田间播种，调查出苗率、绿苗率。 　　普通种子常规浸种催芽。播种于单孔穴盘，幼苗子叶完全展平及真叶如贰分硬币大小时，挑选生长一致的幼苗进行Kan处理。连续重复处理3次，每个处理每个重复50株，7 d后调查子叶反应。调查标准参阅祝建波等人的方法。 　　 　　0级：叶片正常。 　　1级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色略有差异，但不明显，叶色仍为绿色。 　　2级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色对比加深，差异较明显，叶色变浅。 　　3级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异明显。叶色由绿转黄。 　　4级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色由黄逐步转白。 　　5级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色由白逐步转褐，并稍有破损。 　　6级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色基本变褐。破损极为严重。 　　 　　1.3转化种子的筛选 　　每个品种、每个处理随机取500粒花粉管通道法转化的甜瓜种子，使用Kan临界浓度处理种子、幼苗，提取Kan+绿苗的基因组DNA，进行PCR及Southern杂交检测。 　　 　　2、结果与分析