EGFR在IL―1β介导下人牙龈成纤维细胞表达研究.docVIP

EGFR在IL―1β介导下人牙龈成纤维细胞表达研究 　　摘 要：目的：观察表皮生长因子受体（EGFR）在IL-1 干预下在牙龈成纤维细胞中的表达。方法：利用免疫组化的方法，先建立了人牙龈成纤维细胞的体外模型，然后将细胞随机分为六组，对照组加入DMEM培养液（无血清），实验组为IL-1 浓度分别为0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的培养基（无血清），静置培养24h。结果：数据分析结果运用了SPSS统计软件，差异具有统计学意义，P0.05，EGFR胞浆染色强度随IL-1 由于升高的干预浓度有增强趋势。结论：牙龈组织炎症的发生发展中EGFR起着重要的作用，为进一步研究EGFR在牙龈组织炎症中的调控作用提供实验基础，对于早期终止和治疗牙周组织炎症进程有很大的意义。 　　关键词：牙龈成纤维细胞 表皮生长因子受体 免疫组织化学 　　中图分类号：R329.2+8 文献标识码：A 文章编号：1007-3973（2013）008-105-03 　　人牙龈结缔组织中的重要地细胞包括人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs），对修复和保护牙周组织发挥着重要作用。表皮生长因子（epidermal grow thfactor，EGF）在细胞生长和分化起着重要的作用，对伤口愈合、保护粘膜起着重要作用。表皮生长因子受体（EGFR）在口腔粘膜各个部位都存在表达，唾液中有高浓度的EGF存在，推测口腔牙周和粘膜的病变与EGF和EGFR这对调控因子有关。本实验人牙龈成纤维细胞的体外模型的成功建立，再采用免疫组织化学方法观察健康牙龈成纤维细胞与炎症牙龈成纤维细胞中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的表达，探讨表皮生长因子及其受体与牙周炎发病机制间的关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要仪器和试剂 　　DMEM 培养液（Sigma，美国）；胰蛋白酶（Gibco，美国）；胎牛血清（四季青，杭州）；DAB显色试剂盒、免疫组化试剂盒、抗波形丝蛋白抗体、抗角蛋白抗体（北京优尼康生物科技有限公司）；六孔板、25 ml 塑料培养瓶（Orange scientific，比利时）；RCO3000-7 CO2培养箱（Gibco，美国）；GB-Ⅱ超净工作台（北京优尼康生物科技有限公司）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂）。EGFR多克隆抗体美国Santa Cruz公司IL-1 ，美国Peprotech公司；BI-2000医学图象采集分析系统成都泰盟科技有限公司；Image Pro Plus6.0图象分析系统美国Media Cybernetics，Inc。 　　1.2实验方法 　　1.2.1 IL-1 干预人牙龈成纤维细胞 　　首先，人牙龈成纤维细胞体外模型的成功建立，取5～8代形态良好，生物性稳定的且活力旺盛的人牙龈成纤维细胞，制备成细胞悬液（1～2??5/ml）。干燥无菌的六孔板内放置已高压灭菌好的盖玻片。将细胞悬液滴在盖玻片上，每孔200 l以悬液不溢出为好但铺满玻片，静置5分钟后，在CO2培养箱孵育4～6小时。待玻片上细胞良好贴附，加入每孔内加入2ml新鲜培养液。干预爬满玻片尚未连接成片且伸展良好时的细胞：将细胞随机分为六组：对照组加入DMEM培养液（无血清），实验组IL-1 的浓度依次为0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的培养基（无血清），培养静置24h。 　　1.2.2 人牙龈成纤维细胞IL-1 干预后的形态学观察 　　IL-1 浓度分别为0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml来干预人牙龈成纤维细胞，利用倒置显微镜24h后观察HGFs形态学的变化，再对比正常HGFs形态。 　　1.2.3 免疫组织化学检测EGFR 　　以不同浓度IL-1 分别加入细胞爬片中，取出细胞爬片在24小时后，固定用多聚甲醛（4%），参看免疫组化试剂盒的说明，利用二步法的操作、显色（DAB）、复染（苏木素），对EGFR的免疫组织化学染色检测，一抗由磷酸盐缓冲液代替为阴性对照组，观察染色结果在光镜下。 　　1.2.4图像采集 　　数据的采集和图像的分析，是利用BI-2000医学图像分析系统，再对实验结果进行统计学分析。 　　1.2.5 统计学分析 　　10个视野随机从各浓度组的细胞染色结果中选取，用Image Pro Plus6.0图像分析系统对随机选取的的图片进行光密度分析。由SPSS 11.0软件包处理，各组间参数利用均数加减标准差（x?s）表示，进行数据分析利用单因素方差分析法（one-way ANOVA），差异有统计学意义（P0.05），