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Syndecan1在结肠腺瘤及腺癌中表达研究 　　【摘要】 目的：研究syndecan-1在结肠腺瘤及腺癌中的表达，探讨其与结肠腺瘤及结肠癌的关系。方法：分别采用免疫组织化学染色技术（immunohistochemistry，IHC）以及逆转录-聚合酶链反应技术（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR），检测结肠腺瘤、腺癌及正常肠道组织中syndecan-1 mRNA和蛋白的表达，初步分析其与腺癌的临床病理特征的关系。结果：免疫组化及RT-PCR均显示，syndecan-1在正常组织中明显高表达，而腺癌呈明显低表达，腺瘤则介于两者之间，三者之间差异有统计学意义（P0.05）。结论：syndecan-1主要表达于正常肠黏膜组织，在腺瘤中表达有所减弱，在腺癌中的表达则明显减弱。这提示细胞间粘附的破坏在结直肠的致癌机制中可能起关键作用。 　　【关键词】 syndecan-1； 结肠腺瘤； 腺癌 　　结肠腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率、死亡率均居恶性肿瘤的前列，且有逐年上升的趋势。1974年Morson提出了大肠癌发生的“腺瘤-癌”顺序，这一观点已逐步得到认可[1]。有研究证实80%以上的结肠癌是由结肠腺瘤恶变而来[2-3]。流行病学、病理学以及临床研究等均说明大肠腺瘤为大肠癌主要的癌前病变。 　　Syndecan-1是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的成员，能与许多对血管发生与修复、免疫细胞生长、细胞-细胞/细胞-细胞外基质间粘附起调节作用的配体如生长因子、细胞因子、趋化因子和细胞外基质等相互作用，从而在形态发生、组织修复、宿主防御、能量代谢中发挥重要作用[4-5]。研究发现Syndecan-1在人类多种恶性肿瘤组织表达显著降低[6-7]。笔者就syndecan-1在结肠腺瘤及腺癌组织中的蛋白及RNA水平的表达及意义进行研究，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 标本来源 腺瘤及腺癌组织标本取自2010-2011年广州市番禺区中心医院消化内科内镜活检组织，所有标本均经病理证实。正常组织取自肠易激综合征患者（均知情同意），肠镜检查为正常肠道。48例腺瘤患者中男30例，女18例，年龄33～75岁，平均51岁。32例结肠癌患者中男21例，女11例，年龄42～80岁，平均56岁。 　　所取标本为两部分，一部分取材后即刻置于4%多聚甲醛固定，另一部分即刻置于标本保存液中，3 h内转移至-80 ℃低温冰箱冻存。 　　1.2 实验试剂 小鼠抗人syndecan-1（CD138）多克隆抗体由南方医科大学消化内科陈烨教授惠赠。小鼠抗人免疫组化检测试剂盒（SP-9002试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司），DAB显色试剂盒（购自北京中杉金桥公司），TRIZOL 反应剂（购自Invitrogen公司）。 　　1.3 免疫组织化学方法检测syndecan-1 采用免疫组织化学SP法，所有标本进行常规石蜡包埋，切片（4 μm）后脱蜡并水化，于PBS溶液中进行微波抗原修复；采用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶15 min；正常山羊血清封闭，室温30 min；滴加山羊抗小鼠syndecan-1多克隆抗体（1：600），4 ℃过夜。滴加生物素标记的IgG抗体（二抗）和链霉卵白素三抗，DAB显色2 min，进行苏木素复染，氨水返蓝，烤干后封片，置于显微镜下观察。 　　1.4 免疫组化结果分析 采用半定量积分法，凡细胞浆内或核膜上呈棕黄色者为阳性，根据染色强度和显色细胞的比例进行综合评分。（1）按组织显色深浅评分：无显色者为0分，呈浅黄色或黄色者为1分，呈棕黄色者为2分，呈棕褐色者为3分。（2）以细胞着色比例分级为：25%的细胞着色，计0.1分；26%～50%的细胞着色，计0.4分；51%～70%的细胞着色，计0.6分；71%～100%的细胞着色，计0.9分。（3）每张切片的积分为（1）×（2）。 　　1.5 syndecan-1 mRNA逆转录--聚合酶链式反应分析 用TRIZOL反应剂从20～100 mg肠黏膜中提取总RNA。将3 μg RNA置于10 μL逆转录反应系中转录为cDNA。采用Random 9 mers 引物和AMV进行逆转录并行PCR扩增，扩增反应条件：预变性94 ℃，10 min，变性94 ℃，45 s，退火63 ℃，1 min，延伸72 ℃，1 min，35个循环，延伸72 ℃，10 min。引物GAPDH上游：5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3’；GAPDH下游：5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’（197 bp）；syndecan-1上游：5’-tcaccttgtcacagcagacc-3’；syndecan