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三维细胞培养技术在流感病毒监测中的应用研究 　　【摘 要】目的：建立三维细胞培养技术（TDCC）在流感病毒培养中的方法。方法：尝试建立三维细胞培养技术在流感病毒培养中的方法，并比较三维细胞培养技术与传统贴壁细胞培养技术传代细胞得率及病毒培养效果及三维细胞培养方法对于流感病毒核酸分型检测的有效性。结果：三维细胞培养技术在细胞传代得率是贴壁细胞培养技术6.67倍，传代后细胞用作病毒培养效果比较差异并不明显（P |t| = 0.5943），流感核酸未分型标本的三维细胞培养比普通贴壁培养更快速有利于核酸分型检测。结论：三维细胞培养技术将具有三维结构不同材料的载体与MDCK细胞在体外共同培养，构成三维的细胞-载体复合物]，使得细胞生长有效面积远高于贴壁细胞培养技术，使细胞传代中细胞得率远高于贴壁细胞培养，三维细胞培养的收获的细胞与贴壁细胞培养收获后的细胞用于流感病毒培养效果并没有明显差异，利用三维构架下染毒的方法来提高病毒培养物效价和对于核酸未分型标本的检测有一定的应用价值。 　　【关键词】三维细胞培养；流感病毒；监测 　　【中图分类号】R372 【文献标识码】A 【文章编号】1004―7484（2013）09―0118―01 　　2009年5月，新甲型H1N1病毒造成世界范围内的大流行，2013年春季在中国长三角地区流行甲型H7N9流感病毒，加强对流感病毒监测对于疫情分析、流行趋势研判、疫苗研制等方面有着极其重要的意义。目前国内在流感病毒监测方面主要采用核酸检测和单层贴壁细胞培养技术。由于标本采集的问题及细胞在体外环境下生长逐渐丧失了原有的性状[1]，在很多情况下，所取到的研究结果和实际结果不符合。传统单层细胞培养得率过低是大量病毒监测工作中难以突破的的瓶颈。我们建立了三维细胞培养技术方法在流感病毒的网络监测中得到较好的应用。 　　1 材料与方法 　　1.1 样本采集：上海市黄浦区流感网络监测定点医院（第二人民医院）流感监测点于2013年1-2月冬春季采集的类流感病例鼻咽拭子合计76份。 　　1.2 核酸抽提：取鼻咽拭子病毒采样液140微升，使用QIACUBE?核酸抽提仪，试剂使用QIAamp? Viral RNA Mini Kit（250）试剂盒提取病毒RNA。 　　1.3 流感病毒核酸检测：Real-Time RT- PCR检测使用上海之江生物技术有限公司甲型流感病毒核酸检测试剂盒（A型/B型流感核酸检测试剂盒、H1、H3、H1N1（2009pdm）型核酸检测试剂盒），PCR扩增仪使用国产上海宏石SLAN荧光定量PCR扩增仪。反应条件如下：45 ℃ 10 min逆转录，95 ℃ 15 min变性，95 ℃ 15s，60℃ 1min FAM通道检测荧光，40个循环。 　　1.4三维细胞培养 　　1.4.1培养仪：采用Hamilton?公司的BioLevitator?三维细胞培养仪。 　　1.4.2细胞来源：75mL细胞培养瓶复苏的狗肾细胞（MDCK），消化后得到悬浮细胞。将悬浮细胞接种到GEM微载体上，在培养设备上运行接种程序。当细胞生长覆盖率达到80%以上时，加入两倍量的新的GEM微载体。继续培养，在培养过程中根据需要更换新的培养基。当细胞生长覆盖率达到80%以上时，将培养管内溶液分装到三个新的培养管中。向三管中分别加入两倍于原体积的新培养基和两倍于原数量的GEM微载体。在培养设备上运行接种程序。 　　1.4.3细胞生长：当细胞生长覆盖率达到80%以上时，取出培养管，用磁铁吸住GEM微载体，移去培养基。用3-Dissolution试剂将GEM微载体溶解，用磁铁吸去磁性颗粒，得到细胞。转移细胞溶液至新的50mL管中，将细胞清洗、悬浮后细胞分装并计数。细胞样品可以用于下游的检测或其它应用。 　　1.4.4接种病毒 　　1.4.4.1接种中毒：当细胞生长覆盖率达到要求后，开始进行病毒感染实验。采用上述9份季节性流感病毒H3核酸检测阳性标本分A、B组进行染毒试验。A组为贴壁细胞培养的细胞，B组为三维细胞培养的细胞。置37?C， 7.5% CO2浓度培养，每天观察，当有90%的细胞出现CPE后，进行收毒。 　　1.4.4.2收毒后的病毒液可以用移液管吸入离心管，在1，000-2，000转下离心10mins，以此除去细胞碎片，将离心后的上清夜转移，弃底部沉淀，该上清液进行病毒滴度测定。 　　1.4.5 三维细胞培养细胞的观察与计数 　　1.4.5.1取50μL培养液（cells on GEM?）至96孔板中的一个孔内。加入100μL Hoechst 33342溶液到该孔内。室温下放置15-20分钟。用显微镜在紫外和DAPI滤光片下观察。 　　1.4.5.2细胞计数用CubeMagnet将剩余的400μL