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不同分离方法对黄鳝肝细胞活性的影响 　　摘要：探讨了组织块贴壁法及酶消化法（胰蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶-EDTA、胰蛋白酶-EDTA-胶原酶）对分离黄鳝（Monopterus albus）肝细胞的细胞数量、细胞活力和细胞增殖能力的影响。结果表明，酶消化法优于组织块贴壁法，其中胰蛋白酶-EDTA-胶原酶分次消化法所获得细胞数量最多，为（1.30±0.06）×107个/g，胰蛋白酶消化法所得细胞活力最高，为（90.2±1.2）%，胰蛋白酶-EDTA-胶原酶分次消化法所获得活细胞数量最多，为（1.10±0.05）×107个/g。细胞增殖能力呈先升后降的趋势，在48 h细胞数量最多，144 h后细胞数量明显下降。 　　关键词：黄鳝（Monopterus albus）；肝细胞；分离；活性；培养 　　中图分类号：S917 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5543-03 　　肝脏是脊椎动物最大的解毒和营养代谢器官，是目前药理学、毒理学和生理学等研究的主要对象。已有大量研究表明，体外培养的肝细胞可作为活体肝组织替代模型应用于药理、毒理、生理等方面的研究。鱼类的肝细胞培养晚于哺乳动物，目前已有报道40多种鱼类的肝细胞被分离并进行体外培养，包括常见的草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[1]、鲤（Cyprinus carpio）[2]、鲫（Carassius auratus）[3]、罗非鱼（Oreochromis Niloticus）[4]等，花鲈（Lateolabrax japonicus）[5]、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）[6]等鱼类的肝细胞已建立细胞系。这些原代培养的肝细胞以及已建立的肝细胞系也被广泛应用于药理、毒理、生理等方面的研究[7]。黄鳝（Monopterus albus）属合鳃鱼目合鳃鱼科黄鳝属，是一种无鳞鱼类，目前关于黄鳝肝细胞的培养及应用还鲜见报道。本研究比较了不同分离方法对黄鳝肝细胞的数量、活力及增殖能力的影响，为建立黄鳝肝细胞体外培养体系及作为黄鳝的药理、毒理、生理学等相关研究的体外模型的应用奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　试验黄鳝体重约为50 g，饲养于长江大学黄鳝养殖基地。 　　1.2 试剂 　　PBS（Hyclone公司），青链霉素、台盼蓝、胰蛋白酶、MTT（Amresco公司），小牛血清、M199培养基（Gibco公司）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 肝细胞的分离 ①组织块贴壁法。将黄鳝断尾放血处死，在体积分数为70%的无水乙醇中浸泡5 min，在超净工作台中取出肝胰脏组织，放入培养皿中用预冷的PBS溶液进行漂洗。用眼科剪剪成1～2 mm3的小块并除去杂质。将组织块转入24孔板内，每孔放2～3块，静置2～3 h使组织块贴壁，吸走多余液体后每孔加2 mL培养液，置于25 ℃、5% CO2培养箱内静置培养，每24 h倒置显微镜下观察细胞生长状况。②胰蛋白酶消化法。按上述方法取出肝胰脏组织，按其肝脏体积的5倍左右加入体积分数为0.25%的胰蛋白酶室温消化20 min，用血清终止其消化并收集肝细胞，用100目筛网过滤并收集细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复3次，随后加入培养液制成细胞重悬液。③胶原酶消化法。按上述方法取出肝胰脏组织，按其肝脏体积的5倍左右加入体积分数为0.1%的胶原蛋白酶Ⅳ室温消化60 min，用血清终止其消化并收集肝细胞，用100目筛网过滤并收集细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复3次，随后加入培养液制成细胞重悬液。④胰蛋白酶-EDTA消化法。按上述方法取出肝胰脏组织，按其肝脏体积的5倍左右加入体积分数为0.25%的胰蛋白酶-EDTA，室温磁力搅拌消化30 min，用血清终止消化并收集细胞，用100目筛网过滤并收集细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复3次，随后加入培养液制成细胞重悬液。⑤胰蛋白酶-胶原酶-EDTA消化法。按上述方法取出肝胰脏组织，按其肝脏体积的5倍左右加入体积分数为0.1%的胶原蛋白酶Ⅳ室温消化30 min，然后加入体积分数为0.25%的胰蛋白酶-EDTA 4 ℃消化30 min，用血清终止消化并收集肝细胞，用100目筛网过滤并收集细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复3次，随后加入培养液制成细胞重悬液。 　　1.3.2 肝细胞活力的测定 将细胞重悬液与质量分数为0.4%的台盼蓝按9∶1混合，在显微镜下血球计数板上计数。活细胞为圆形透明，死细胞被染成蓝色，用活细胞占总计数细胞中的百分比表示细胞活力。 　　1.3.3 肝细胞的原代培养 用含10%（V/V）小牛血清