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一种提取真菌基因组DNA的新方法 　　摘 要：真菌基因组高通量测序对DNA纯度和含量要求较高，通过月桂酸钠法、CTAB法和酶裂解法分别提取真菌基因组DNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 1000测定DNA浓度和纯度，结果证明月桂酸钠法提取的真菌基因组总DNA更适合应用于真菌基因组高通量测序。 　　关键词：月桂酸钠法 真菌 基因组DNA 　　真菌为低等真核生物，种类庞大而多样 [1]，在最近的几年里，随着测序技术的不断提高和大片段测序价钱的降低，大量真菌被测序，真菌基因组学研究快速发展。特别是真菌比较基因组学的分析已成为生物进化、系统发生学、药物靶基因、基因发现以及基因功能等方面的研究 [2-3]。而真菌基因组DNA的浓度和纯度直接关系到真菌基因组的测序和组装，从而进一步影响后续的基因注释及分析。高质量和大片段（30 kb）的真菌基因组DNA可以用于10 kb文库构建和高通量测序。有些真菌由于色素、多糖含量较高，使得传统CTAB方法提取不能获得高纯度、大量的基因组DNA，给后续测序工作带来很大难度。例如，产黄青霉（Penicillium chrysogenum） [4]，该菌产生色素很多，用传统方法很难完全去除色素；对于一些含糖量多的真菌，如冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）中至少含有20种多糖，约占虫草总干质量的3 %～ 8 % [5]，这一类真菌传统方法提取的基因组DNA是达不到高通量测序的要求的。试验采用月桂酸钠法、CTAB法和酶解法分别提取了相同的4株真菌基因组总DNA。这4株真菌都属于Ophiocordyceps sinensis菌株，多糖和色素含量较多。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 供试菌株 　　Ophiocordyceps sinensis菌株4株，由中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室刘杏忠研究员课题组提供。真菌在铺有玻璃纸的PDA培养基上培养，25 ℃，7～20 d。 　　1.1.2 仪器 　　恒温电热水槽，电子分析天平，低温离心机，移液器，NanoDrop 1000，电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统 　　1.1.3 主要试剂 　　液氮、1 %月桂酸钠、100 mM NaCl、Tris饱和酚、氯仿-异戊醇（24+1）、异丙醇、70 %乙醇（v/v）、无菌ddH2O、RNase A（Sigma，100 mg/mL）、RNase T1（Fermentas，1000 U/μl，用TE稀释至1000 U/mL）。 　　1.1.4 溶液配制 　　1 %月桂酸钠裂解液：100 mM Tris-HCl（pH 8.0），20 mM EDTA，1 % 月桂酸钠，100 mM NaCl，121 ℃灭菌30 min。 　　TE（pH 8.0）：10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA，1×105 Pa灭菌30 min。 　　CTAB 裂解液：100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、20 mM EDTA（pH 8.0）、1.4 mol / L NaCl。 　　3M 乙酸钠（pH 5.5）：称取24.61 g乙酸钠，加80 mL ddH2O溶解，用乙酸调节pH至5.5，加ddH2O定容至100 mL，0.22 μm滤膜过滤除菌。 　　裂解缓冲液：50 mM Tris?HCl（pH 8.0），50 mM EDTA，1 % SDS，10 mM NaCl，1×105 Pa灭菌30 min。 　　蛋白酶 K（Sigma，10 mg/mL，用无菌ddH2O溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌）。 　　1.2 真菌基因组总DNA提取方法 　　1.2.1 月桂酸钠法提取真菌基因组总DNA 　　用无菌药匙从PDA培养皿中刮取菌丝至无菌研钵中，加液氮用无菌研棒充分研磨至粉末状。在研钵中不断加入液氮，使菌丝在液氮中得到保护，避免基因组DNA降解。研磨时不断连续研钵，当液氮快要挥发完时再次加入，切勿使液氮完全挥发后再加入。提前称量无菌50 mL离心管重，小心将粉末分装至无菌50 mL离心管中（每管不超过2.5 g菌丝粉末），室温放置1～2 min，再称量50 mL离心管重，计算样品粉末重量。将真菌粉末加入预冷离心管，加入1 %月桂酸钠裂解液（按照1 g粉末加入7 mL 月桂酸钠裂解液的比例），用手不断晃动离心管颠倒混匀，15～20 min后，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液（25+24+1），充分颠倒混匀，12000 rpm离心10 min。吸取上清液至一新无菌50 mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24+1），轻柔颠倒混匀，12000 rpm离心10 min。吸取上清液至一新无菌50 mL离心管中，加入等体积异丙