一株产苯乳酸米根霉鉴定及产物分析.docVIP

一株产苯乳酸米根霉的鉴定及产物分析 　　 【摘要】从甜酒曲中筛选到一株产苯乳酸的根霉。该根霉菌丝体可以在35℃,pH7.4的条件下催化苯丙酮酸转化成苯乳酸。经过44h反应,转化液中苯乳酸浓度达到0.97mm。对菌株进行形态学观察和18S rDNA序列分析,确定其在分类学地位上属于米根霉菌属,命名为Rhizopus oryzae sp.2009。 　　 【关键词】米根霉 苯丙酮酸 苯基乳酸 18S rDNA 　　 苯乳酸(Phenyllactic acidPLA)是一种新型天然防腐剂,在食品行业有广阔的应用前景[1]。 苯乳酸的生产方法包括化学合成法和生物转化法,生物转化法正处在研究阶段,已经筛选到了一批可以生产苯乳酸的乳酸菌,并发现乳酸脱氢酶是催化反应的关键酶[2]。考虑到根霉属的真菌尤其是米根霉,同样具有较强的乳酸脱氢酶活力[3],目前尚未有米根霉产苯乳酸的报道,文中从甜酒曲中分离出一株米根霉,并对产物进行了定量分析,验证了米根霉能够催化苯丙酮酸合成苯乳酸。 　　 1.材料与方法 　　 1.1菌种来源:苏州甜酒曲。 　　 1. 2 培养基:PDA固体培养基。 　　 1.3试剂:苯乳酸标品购自Sigma(USA)公司;Taq酶,凝胶回收试剂盒,PMD18-T 载体购自TaKaRa(Japan);其他试剂为国产分析纯。 　　 1.4 菌种筛选:霉菌分离常规方法。 　　 1.5菌丝体制备:调整Rhizopus oryzae sp.2009 PDA孢子浓度为5×106个/ml。按5%(v/v)接种量接种摇瓶,30℃,180r/min培养40h,然后将菌丝过滤,用灭菌的pH7.4磷酸缓冲液洗涤3次备用。 　　 1.6 苯乳酸转化条件:将0.164g苯丙酮酸溶解于100ml pH7.4磷酸缓冲液中,0.22μm滤膜过滤除菌,放入制备好的菌丝体。反应体系置于恒温摇床上,35℃,180r/min下反应50h,取样,HPLC检测。 　　 1.7 18S rDNA序列分析方法 　　 1.7.1基因组DNA 的提取:玻璃珠法破壁,酚法去蛋白,异丙醇沉淀DNA。 　　 1.7.2 18S rDNA 的扩增:本实验采用真菌18S rDNA通用引物R1(5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3)R2 (5-TCCGCAGGTTCA 　　CCTACGGA-3)。PCR 扩增程序:95℃预变性2 min;94℃变性45s,52 ℃退火1 min,72℃延伸45s,30次循环;72℃延伸5 min。 　　 1.7.318SrDNA基因序列分析:测序工作由上海生物工程技术公司完成,测序结果提交BLAST软件检索比对。 　　 1.8反相高效液相色谱法检测PLA[4] : 色谱条件参考Valerio方法。 　　 2.结果与讨论 　　 2.1 18S rDNA鉴定结果 　　 2.1.1 基因组DNA 的提取:从图1中可以看出基因组DNA呈现一条清晰明亮的条带,纯度较高,DNA分子长度在4000bp左右,符合PCR反应要求。 　　 　　 图1 基因组DNA电泳图2PCR产物电泳检测 　　 2.1.2 18S rDNA 的扩增:PCR产物电泳结果如图2。产物PCR片段长度为1800bp左右,符合使用霉菌通用18SrDNA引物的预期扩增结果 [5]。 　　 2.1.3霉菌18SrDNA基因序列测序结果分析。18SrDNA基因序列提交到GenBank进行Blast检索,发现其与Rhizopus oryzae 同源性最高,达到99%,确定为米根霉,命名为Rhizopus oryzae sp.2009,18S r DNA序列已提交GenBank,登记号为GU126375。 　　 2.2反相高效液相色谱检测 　　 转化产物的HPLC分析。 　　 　　苯乳酸标品转化液样品 　　图3转化液样品HPLC图谱 　　 如图3所示。苯乳酸标品保留时间与样品中苯乳酸保留时间相差不超过0.1min,峰型规整。根据对峰面积的定量分析可以得出样品中苯乳酸浓度。 　　 2.4苯乳酸的生物转化 　　 如图4可以看出,44h后苯乳酸含量达到最大值0.97mm。催化反应所需时间较长,原因是乳酸脱氢酶为胞内酶[6],反应底物及产物必须通过细胞壁和细胞膜进行运输,细胞膜的通透性对于反应速度及转化率具有较大的影响。44小时以后,产物浓度有下降趋势,由于乳酸脱氢酶催化反应的可逆性,酶促反应在苯乳酸的生成与逆反应间达到平衡。同时,苯丙酮酸化学性质不稳定、容易分解,导致苯丙酮酸逐渐减少,所以反应向生成苯乳酸的逆反应方向发展,产物含量随之降低。米根霉的苯乳酸产量与已经报道的乳酸菌比较相对较弱,但是米根霉产苯乳酸现象的发现为苯乳酸的生物转化研究工作提供了