一株拮抗香蕉枯萎病菌内生细菌抑菌机制研究.docVIP

一株拮抗香蕉枯萎病菌内生细菌的抑菌机制研究 　　摘 要 采用生物化学方法，分析了一株香蕉内生细菌BEB99发酵液的乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌4号小种（FOC4）的抑菌机制，结果表明，其对香蕉枯萎病菌菌丝脂质过氧化、麦角甾醇含量、蛋白质含量及果胶酶活性均有一定的影响，但不能产生几丁质酶。 　　关键词 内生细菌 ；劳尔氏菌 ；尖孢镰刀菌；抑菌机制 　　分类号 S432.4+2 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.010 　　Abstract The antagonistic mechanisms of ethyl acetate crude extract of BEB99 strains for Fusarium oxysporium were studied by biological chemical method. The results revealed that ethyl acetate crude extract could influence lipid peroxidation， ergosterol content， protein content， the activity of PMG of Fusarium oxysporum. But it could not decompose the chitin. 　　Keywords Endophytic bacteria ； Ralstonia sp. ； Fusarium oxysporum ； antimicrobial mechanism 　　植物内生细菌是指生活于植物的组织和器官内部而不引起症状的细菌，其中很多菌种在病害生物防治和促进植物生长发育等方面具有潜在的应用价值[1]。内生细菌的生防机制主要包括竞争作用、拮抗作用和诱导抗性，其中拮抗作用是生防菌主要的抗菌机制。生防菌产生的拮抗物质主要包括细胞壁降解酶类，如几丁质酶或葡聚糖酶、抗菌蛋白、抗菌肽和挥发性物质等[2]。 　　香蕉是中国重要的热带经济作物。由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的香蕉枯萎病是一种毁灭性的土传病害。已有研究表明，利用内生细菌生物防治香蕉枯萎病具有较好的防治效果[3]。本实验室以香蕉枯萎病菌为指示菌，经筛选获得一株具有抑菌活性的内生细菌BEB99，该菌株经鉴定为劳尔氏菌（Ralstonia sp.），其发酵液的石油醚和乙酸乙酯粗提物对香蕉枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发均具有明显的抑制作用，可造成病菌菌丝的畸形，抑制孢子萌发。为进一步了解该菌对香蕉枯萎病菌的作用机制，笔者研究了该菌发酵液的乙酸乙酯粗提物对菌丝脂质过氧化、麦角甾醇含量、蛋白质含量及果胶酶活性的影响，以期为该菌株下一步的应用研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 供试菌株 　　香蕉内生细菌BEB99和香蕉枯萎病病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种（Fusarium oxysporium f. sp. cubense （Smith） Snyder Hansen race 4， FOC4）均由本实验室分离和保存。 　　1.1.2 培养基和试剂 　　NA培养基、优化培养基（4 g/L葡萄糖，1 g/L酸水解酪蛋白，0.5 ml/L的1 mol/L MgCl2，1 ml/L的1 mol/L CaCl2，pH 6.5）、PDA培养基、PDB培养基、乙酸乙酯、几丁质培养基（胶状几丁质15 g，酵母膏3 g，KH2PO4 1.36 g，NH4SO4 1 g，MgS04?5H2O 0.3 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 BEB99菌株发酵液制备 　　将保存的内生细菌BEB99菌株接种于优化平板培养基中，于28℃中活化24 h；将活化的BEB99菌株接入50 mL优化的液体培养基中（150 mL三角瓶），于28℃、180 r/min条件下振荡培养36 h，制成种子液；再将种子液以7%的接种量接入优化培养液中，于相同条件下培养36 h，制备BEB99菌株的发酵液。 　　1.2.2 BEB99菌株发酵产物分离 　　将浓缩的发酵产物用细胞超声破碎仪破碎后，用250 mL乙酸乙酯有机溶剂与发酵液等体积混合，在1 000 mL分液漏斗中反复颠倒振荡30 min，使其萃取充分，静置过夜，萃取3次，合并有机相，将有机相减压浓缩成浸膏，用乙酸乙酯溶剂定容，备用。 　　1.2.3 菌丝体处理方法 　　将FOC4分生孢子悬浮液接种于50 mL PDB中（分生孢子最终浓度为1×107 个/mL），于28 ℃静置培养5 d；加入乙酸乙酯相提取物使其终浓度分别为50、100、150 μg/mL，继续静置培养5 d