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一株生物乳化剂产生菌的筛选及其特性研究 　　摘要：从滨州地区石油污染盐碱土壤中分离出一株具有高产生物乳化活性的菌株SJ，经生理生化试验和16S rRNA测序分析，初步鉴定为该菌株属于沙雷氏菌属，命名为Serratia sp. SJ。对菌株SJ的生长条件进行了研究，结果表明：菌株SJ对NaCl的最适生长范围为0%～4%，生长最适pH值范围是7～10。菌株经发酵培养，测定发酵液对柴油的乳化指数为100%。采用盐沉法从发酵液中提取到生物乳化剂，得率为0.75 g/L。经定性和定量分析，该乳化剂由糖类、蛋白质和脂类三部分组成，比例分别为34.7%、41.5%和16.0%。菌株SJ及其产生的生物乳化剂在石油污染治理方面具有潜在的应用价值。 　　关键词：乳化剂；乳化剂提取；生理生化鉴定；耐盐菌；耐碱菌 　　中图分类号：Q939.9 　　文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2015）10-0279-03 　　1 引言 　　生物乳化剂是一类由微生物代谢产生的大分子生物表面活性物质，大多是由多糖、蛋白质、脂质，或者这些物质的复合物组成[1～3]。乳化剂可以将油滴乳化成许多细小的颗粒，从而增大油滴可利用的表面积，有利于微生物的直接接触和利用，可以极大地改善微生物对油污土壤的净化效果[4]，成为石油污染治理中的研究热点[5]。 　　国内对乳化剂也有广泛的研究。朱万琴[6]等人就对乳化剂菌株进行了初步筛选和研究；李彩凤等人，研究了高温产乳化剂菌株SL-1的最适生长条件，并对乳化剂进行了定性分析和研究。李国强[3]等人对嗜热解烃菌DM-2产生的乳化剂进行了详细的研究。然而，少见来自盐碱环境中产生物乳化剂微生物的分离和研究的相关报道。 　　滨州地区位于黄河下游、鲁东平原、地处黄河三角洲腹地，北邻渤海湾。土壤以盐碱土为主，土壤中参照的微生物抗逆性较强。本实验从该地区石油开采区采集石油污染土壤，分离得到一株高产生物乳化剂的菌株SJ，对菌株的耐盐碱特性、产生物乳化剂条件，以及乳化剂的理化性质进行了研究。 　　2 材料与方法 　　2.1 土壤样品 　　本实验所用土样采集自滨州地区石油开采区。 　　2.2 实验材料 　　富集培养基[7，8]：K2HPO44.35 g，KH2PO41.7 g，NH4CL2.1 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，FeSO4?7H2O0.01 g，CaCl2?2H2O0.03 g，石蜡5%。 　　发酵培养基[7，8]：K2HPO4?3H2O4.8 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41 g，柠檬酸三钠0.5 g，MgSO4?7H2O0.2 g，葡萄糖2 g，酵母提取物0.1 g，CaCl2?2H2O0.002 g，MnCl2?4H2O0.0004 g，NiCl?6H2O0.0004 g，ZnSO4?7H2O0.0004 g，FeCl3?6H2O0.0002 g，NaMoO4?2H2O0.0002 g，pH值7.2蒸馏水1 000 mL。 　　2.3 生物乳化剂产生菌的富集和纯化 　　称取定量土样于液蜡培养基中进行富集。培养温度37℃，180r/min，摇床震荡培养，时间7 d，富集3～5次。将富集液进行稀释涂布，培养基采用LB培养基分离纯化。将分离得到的菌株进行分离纯化以备后期乳化性能的测定。 　　2.4 乳化性能的测定 　　将分离到的菌株接种到LB液体培养基中，37℃，180r/min摇床过夜培养。在试管中加入3 mL柴油作为测试烃和7mL培养液，涡旋振荡器充分振荡1 min，静止2 h，以乳化指数（EI24=乳化层高度/有机相总高度）[9，10]表示乳化剂的乳化活性。 　　2.5 菌株的鉴定 　　2.5.1 生理生化反应检测 　　参考常见细菌系统鉴定手册测定。 　　2.5.2 菌株16S rRNA鉴定 　　将筛选得到的菌株进行DNA的提取后，利用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R来扩增16S rRNA基因序列。PCR反应体系的反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min[11]。扩增产物经电泳检测后送北京生物工程公司检测。序列用于系统发育树作图。 　　2.6 产生物乳化剂菌株最适生长条件分析 　　将分离得到的目的菌株接种到发酵培养基中，37℃，180 r/min摇床震荡过夜培养后测定其对柴油的乳化作用。将发酵培养基的初始pH值分别调为7、8、9、10、11、12，初始盐浓度调为0%～9%，接种目的菌株，37℃，180 r/min摇床震荡过夜培养后测定其乳化指数及在600 nm波长下的OD值，以未接菌的空白培养基作为对照[12]。 　　2.