一株苏云金芽孢杆菌自然突变体活性丧失研究.docVIP

一株苏云金芽孢杆菌自然突变体活性丧失的研究 　　摘要：通过对一株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）自然突变体cry1C基因的克隆和测序，分析突变位点对该基因所表达蛋白质结构的影响及活性丧失的原因。 　　关键词：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）；突变体；活性 　　中图分类号：S476.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）08-0069-02 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.018 　　Study on the Loss of Natural Mutant of A Bacillus thuringiensis 　　WEI Min 　　（Henan Nursing Vocational College，Anyang 455000，Henan，China） 　　Abstract： The cry1C gene of a mutant Bacillus thuringiensis natural mutant were cloned and sequenced， and the effects of mutant sites on the protein structure expressed were analyzed by this gene and the causes of loss of activity. 　　Key words： Bacillus thuringiensis； mutant； activity 　　?K云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）简称Bt，其产生的杀虫晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等多种重要的农林业害虫以及线虫、螨类和原生动物具有毒杀作用[1]。菌株G43对夜蛾科害虫甜菜夜蛾有较好的活性，推测其可能含有cry1C类基因[2]，但其基因的具体序列还不清楚。在传代过程中发现其杀虫活性完全丧失，把突变体命名为G39，分析可能是其表达杀虫晶体蛋白的cry基因发生了突变，导致其不能正确地表达杀虫晶体蛋白，造成杀虫活性丧失，为明确该基因发生突变的位点，对该菌株中的cry1C基因及其突变体G39菌株中的基因进行克隆并测序[3，4]，分析其突变位点对该基因表达蛋白构象的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　所用Bt菌株均由中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存；JM109购自Novagen；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　液体LB：Tryptone 1%，Yeast extract 0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，120 ℃ 20 min。 　　酶类：限制性内切酶及连接酶、高保真KOD plus DNA聚合酶、Rnase购自GiBcol、TaKaRa公司。dNTP、Taq酶等购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。DNA回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。 　　Bt总DNA提取液：溶液I，0.3%蔗糖，25 mmol/L Tris?Cl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA（pH 8.0），Lysozyme 50 mg/mL；溶液II，0.1 mol/L NaCl，0.1% SDS，0.1 mol/L Tris?Cl（pH 8.0）；溶液III，5 mol/L NaAc，用冰乙酸调至pH 4.8。 　　1.2 方法 　　Bt总DNA提取、PCR扩增、基因克隆、质粒提取均为常规方法。 　　2 结果与分析 　　2.1 Bt菌株G43和G39中cry1C基因的克隆 　　以菌株G43和G39的总DNA为模版，用cry1C的鉴定引物[1]5′-GTTTAGTGTTGGACGCAATTT-3′和5′-CCAGCGCCACCATTTAA-3′扩增检测出菌株G43和G39中确实含有cry1C类基因（图1）。 　　用全长引物5′-ATGGAGAATAATATTCAAAAT CAATGC-3′和5′-GGAATTACTCCTTATGGAGGAAT AA-3′和KOD plus DNA聚合酶扩增得到全长3.5 kb cry1C的全长DNA（图2）。 　　将产物回收、纯化，利用Taq DNA聚合酶延伸加“A”尾。最终PCR产物经回收纯化后插入pMD18-T载体中，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆并提取质粒，对该质粒进行酶切鉴定（图3）。 　　2.2 Bt菌株G43和G39中cry1C基因的序列测定及分析 　　对经过PCR和酶切鉴定的阳性克隆进行测序，分别测得菌株G43和G39的全长DNA序列。菌株G43的序列通过NCBI BLAST比对，与cry