一株海洋产电菌产碱性蛋白酶初步研究.docVIP

一株海洋产电菌产碱性蛋白酶的初步研究 　　摘 要：从浙江省舟山海域潮间带中得到一株产电细菌M2，经过16S rRNA分子鉴定及生理生化试验，初步鉴定该菌为Shewanella属细菌，并命名为Shewanella sp. M2。菌株M2在脱脂奶平板上能产生明显且较大的水解透明圈，通过Folin-酚法进行酶活测定，初始蛋白酶酶活为110 U/mL，对其进行紫外诱变处理，最终得到酶活为205 U/mL的突变株，酶活提高了86.4%，传代试验结果显示该菌株具有较好的遗传稳定性能。 　　关键词：产电菌；蛋白酶；Folin-酚法；紫外诱变 　　碱性蛋白酶在环保、丝绸、饲料、洗涤剂、食品、医药等领域广泛应用，生产量可以达到酶制剂总产量的40%，经济价值显著[1]。碱性蛋白酶仍然存在品种单一的问题，酶的活性不高，价格昂贵，优质产酶菌株的筛选和选育有着十分重要的应用价值。Kunamneni Adinarayana[2]等发现一种蛋白酶，将其在60 ℃下保温350 min，研究发现该酶仍保持了100%酶活力。Tsuyoshi Nonaka[3]等研究具有抗氧化性能的蛋白酶生产菌，并将其应用于洗涤行业。Raja等[4]利用盐析及层析方法得到的酶，分子量约为51 000 Da，酶活力提高124倍。如今，在极端环境中发现的碱性蛋白酶已经成为研究的热点[5]。 　　碱性蛋白酶的高产菌株仍旧集中在枯草杆菌属，来源较为单一，导致目前的蛋白酶结构也较为单一。目前海洋来源的蛋白酶逐渐成为研究热点，由于菌株所处环境的原因，可能生产出具有独特酶学性质与结构的蛋白酶。 　　本实验室在研究微生物燃料电池过程中发现一株海洋产电菌Shewanella sp. M2[6]，初始?出电压为75 mV，该菌在脱脂奶平板上产生了非常明显的透明圈，通过酶活检测，初始酶活较高，具有很好的选育价值，而产电菌产蛋白酶的报道则很少见，菌株M2具有很好的潜在研究价值。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 培养基 脱脂奶培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠1.0 g，琼脂20.0 g，pH 值72～7.4，加热溶解于1 000 mL海水中，于121 ℃高压灭菌30 min，备用。脱脂牛奶10.0 g，溶于1 000 mL海水中，于115 ℃灭菌30 min。使用前按照1∶1混匀得到培养基。 　　发酵培养基[7-8]：①酪蛋白10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO4 2.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5；②可溶性淀粉40 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，蛋白胨15 g，NaCl 5 g，K2HPO4 3.5 g，NaH2PO4 0.3 g，Na2CO3 0.56 g，人工海水 1 000 mL，调pH 7.5；③蛋白胨5.0 g，酵母膏30 g，葡萄糖5.0 g，人工海水 1 000 mL，pH 75；④牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，脱脂奶10.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5。 　　产电基础培养基[9]：NaCl 20.0 g， KCl 0.745 g，NaH2PO4 0.35 g， Na2HPO4 0.44 g， MgSO4 0.188 g，Wolfe 微量元素溶液10 mL，陈海水1 L。 　　1.1.2 试剂 1 000 μg/mL的标准酪氨酸溶液：将酪氨酸放于100～105 ℃的干燥箱中烘干3 h，冷却后，称取0.1 g溶于10 mL 5 mol/L的盐酸中，再用0.1 mol/L的盐酸稀释100 mL，放置于冰箱中保存。 　　1.1.3 菌种 菌株Shewanella sp. M2，本实验室筛选鉴定后提供，GenBank登录号为KU865683。 　　1.1.4 产电装置 利用试剂瓶型的微生物燃料电池测试产电量。首先，将目标菌种在产电液体培养基中培养至对数期，冷冻离心，加入阳极室并加入一定量的产电培养基，阴极加入等量产电基础培养基，测量电压。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 平板筛选 将纯化后的菌株M2点种于脱脂奶平板上，25 ℃培养，3 d后取出并观察透明圈的产生。 　　1.2.2 酶活测定 将斜面保种的菌株分别接种于4种发酵培养基，装量为50 mL/250 mL，控制转速80 r/min，2～3 d后测酶活。 　　1.2.2.1 标准曲线绘制 　　根据酪氨酸在紫外波长275 nm下具有特征光吸收的原理，利用紫外分光光度法测定酶促反应后在275 nm下的吸光值，得到反应生成的酪氨酸的量，从而计算酶活。按照表1绘制标准曲线。 　　1.2.2.2 酶活测定 　　酶活力定义：以酪蛋白为底物，每分钟水解产生1 μg酪氨酸的