一株海南野生灵芝rDNA―ITS鉴定与系统发育分析.docVIP

一株海南野生灵芝的rDNA―ITS鉴定与系统发育分析 　　摘 要：灵芝是一类重要的木腐真菌，在我国海南岛有广泛分布。研究扩增了1株分离自海南五指山的灵芝菌株rDNA-ITS序列，构建系统发育树，并比较了其与部分亲缘关系较近灵芝的rDNA-ITS序列差异。结果表明，分离自海南五指山的菌株Wzs1与G.resinaceum类群亲缘关系较近，支持聚类的自展值为26%，表明灵芝Wzs1与G.resinaceum类群较相近。 　　关键词：海南；灵芝；rDNA-ITS；系统发育 　　中图分类号 Q933 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）02-14-03 　　灵芝（Ganoderma spp.）是一种重要的腐生型真菌，隶属于真菌界（Kingdom Fungi），担子菌门（Basidiomycota），担子菌纲（Basidiomycetes），灵芝目（Ganodermatales），灵芝科（Ganodermataceae）[1]。野生灵芝的形态特征常常由于受到外部环境的影响产生很大的差异，有伞形、马蹄形等，菌盖有圆形、半圆形或肾形等，菌盖表面一般有光泽或环形纹理。海南岛的热带和亚热带雨林气候为野生灵芝生长发育提供了适宜的温度和湿度，丰富的原始森林为灵芝生长提供充足的营养成分。至今已发现野生灵芝科有103个种，分为4个属，3个亚属，其中海南有72个种，约占总数的70%，表明海南岛是我国野生灵芝分布最丰富的地区之一[2]。本研究利用rDNA-ITS引物，扩增1株灵芝菌株的序列，并构建系统发育树，研究菌株的分类学地位及亲缘关系，以便今后进一步的资源探索和菌株进化研究提供参考借鉴。 　　1 材料与方法 　　1.1 供试菌株分离、培养及DNA的提取 供试菌株Wzs1为灵芝子实体经酒精-次氯酸钠-酒精常规表面消毒后，置放于PDA培养基表面，于25℃恒温培养至长出菌落，纯化后4℃冷藏保存。菌种斜面上挑取菌丝接种至30mLGY液体培养基中，25℃摇床培养14d，收集菌丝用于DNA提取[3]。 　　1.2 PCR扩增及产物的克隆和测序 扩增片段为ITS1、5.8S和ITS2区域，引物为ITS1 （5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） [3]。目的片段的扩增及克隆参照Chen等方法[4]，将含有目的基因片段的菌液委托北京华大基因科技股份有限公司测序。 　　1.3 系统发育学分析及DNA序列差异性比较 根据菌株的rDNA-ITS测序结果，在GenBank数据库中进行Blast比对，搜索同源序列。选取不同种的代表性菌株作进一步的分析。采用Clustalx 1.83[5]将序列对齐，利用MEGA 5.0[6]软件进行系统发育分析，并以自展法（bootstrap）进行检测，循环1 000次，采用邻接法构建系统发育树，其中虎皮香菇（Lentinula tigrinus）作为外群。利用Clustalx 1.83[5]软件将实验菌株序列及部分亲缘关系较近的代表性菌株序列进行比对，找出不同序列间的碱基差异。 　　2 结果与分析 　　2.1 分离菌株的形态特征 在PDA培养基上25℃培养，从表面消毒的子实体边缘生长出白色菌落，具有典型的腐生真菌形态特征。菌落正面白色，棉质，质地紧密，中央隆起或稍有皱褶，边缘疏松，背面泛黄色或淡褐色。 　　2.2 DNA序列组成分析 灵芝菌株Wzs1进行了rDNA-ITS的扩增和测序。扩增产物包括ITS1-5.8S-ITS2区段以及部分18S、25S区段，其中菌株Wzs1扩增长度为674bp，ITS1、5.8S、ITS2序列长度分别为206bp、158bp、215bp，同时将测得的序列提交到GenBank（HQ689698）。 　　2.3 系统发育分析 利用MEGA5.0软件进行系统发育分析，构建NJ树branch length=0.391。系统发育树结构显示：灵芝菌株Wzs1与G.resinaceum类群聚为一支，自展值为26%；这一支包含了G.resinaceum、G.tenue、G.subamboinens和G.weberianum共4个种（图1）。此外，rDNA-ITS系统发育树显示灵芝不同种间亲缘关系的远近，同时G.japonicum与G.sinense这2个种的4株菌株聚为一支，与此相似的还有G.australe与G.adspersum，G.applanatum与G.lipsiense，G.pseudoferreum与G.philippii 6个种，其它各个种菌株各自聚为一支，这些结果反映了rDNA-ITS能够较好地对不同种菌株进行区分（图1）。 　　2.4 DNA序列差异分析 将属于G.resinac