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一种从果树成熟叶片提取DNA的方法 　　摘　要：针对果树成熟叶片富含多糖、多酚及其它次生代谢物质的特点，以8个果树树种的秋季成熟叶片为材料，采用改进的CTAB法对其基因组总DNA进行了提取，并对得到的DNA进行了电泳检测、含量测定和AFLP分析。结果表明，该方法从8种果树的成熟叶片中均能提取出基因组总DNA，且DNA的纯度和完整性都较好，D[260mm，D[280mm]的比值均在1.8-2.0之间，无降解现象。RNA去除干净，能被限制性内切酶完全消化；其AFLP分析(引物组合为EeoRI-TAIMseI-CTT，EcoRI-TT/MseI-CTT)条带清晰，多态性好。说明此方法提取的果树成熟叶片基因组总DNA完全适于AFLP分析。 　　关键词：果树：DNA提取；成熟叶片 　　中图分类号：S66 文献标识码：A 文章编号：1009-9980(2008)01-122-04 　　 　　 　　 　　制备高质量的基因组总DNA是进行分子标记、基因克隆、基因组文库和遗传连锁图谱构建等果树分子生物学研究工作的前提条件。目前，关于各种果树基因组DNA提取方法虽有大量文献报道，但大多以幼嫩组织或器官为试材。而在我国以成熟叶片为材料，且同时适用多种果树的提取方法报道较少。为此，针对果树成熟叶片富含多糖、多酚及其它次生代谢产物的特点，在桃成熟叶片[1]提取成功的基础上。又对其它果树基因组总DNA的提取进行了研究，并对提取产物进行了紫外、琼脂糖凝胶电泳检测及AFLP分析验证，成功地获得了高质量的8个果树树种秋季成熟叶片DNA提取方法，为秋季无法获得幼叶等其它幼嫩材料时从事果树基因组研究打下了基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　桃、苹果、杏、葡萄、李、樱桃、梨和草莓等8种果树的秋季(10月中旬)成熟叶片(表1)，均采自北京市农林科学院林业果树研究所，首先将其放入冰壶中带回实验室，然后再用清水冲洗吸干后置于硅胶中干燥保存备用。每树种随机取2个品种的成熟叶片用于DNA提取纯度、产率及完整性比较研究。 　　 　　1.2　主要试剂及仪器 　　CTAB、SDS、葡萄糖、PVP、β－巯基乙醇、EDTA、Tris和dNTPs均购于上海生物工程公司，用于AFLP反应的预扩增和选择性扩增引物也由上海生物工程公司合成；Tris饱和酚和Taq酶购自华美生物工程公司：其它试剂为国产分析纯。所用离心机为Ep－pendoff5415D型：恒温水浴锅为上海精宏实验设备有限公司DK-S24型；紫外可见分光光度计为上海天美科学仪器有限公司UV-Vis8500型：琼脂糖凝胶电泳仪为北京市六一仪器厂DYY-6C型；PCR仪为美国MJ公司PTC-100型；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪为Bio-rad公司PAC-3000型。电泳槽为C.B.S.公司DH-400-33型。 　　 　　1.3　成熟叶片DNA提取方法及步骤 　　除去中脉的果树成熟叶片0.25 g放人充分预冷的研钵中。加入液氮迅速研磨至粉末状后，立即装入含有1.2mL预热的3％CTAB裂解液[100mlnol/LTris-HCl(pH 8.0)、20 mmmol/L EDTA(pH 8.0)、1.4 mol/LNaCl、3％CTAB(M/V)、2％PVP(M/V)、5％β-巯基乙醇(V/V)1，悬浮沉淀，65℃水浴5 min后，常温下10000 r/min离心10min；弃去上清液，再加人1.2mL提取缓冲液[0.7mol/L NaCl、0.4 mol/L葡萄糖，3％可溶性PVP(M／V)、5％β一巯基乙醇(V，v)]的2.0 mL离心管中，摇匀后，静置10 min，10 000 r/rain常温离心10 min；弃去上清液后，加入l mL预热的3％CTAB裂解液[含2％β-巯基乙醇(V/V)]悬浮沉淀，65℃温浴1 h，其间颠倒混匀3次；水浴后，加入1/4体积的无水乙醇，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1，V/V)，上下颠倒混匀，常温下静置抽提10min，12 000 r/min离心15min；取上清液，加入1/10体积预热的CTAB/NaCl[0.7 mol/L NaCl、10％CTAB(M/V)]溶液，混匀后再加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，V/V/V)，轻轻颠倒混匀，静置10r min.12 000 r/min，常温离心15 rain；取上清液，再加入1/10体积预热的CTAB/NaCl溶液，混匀后加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1，V/V)，轻轻颠倒混匀，静置10min，12 000drain，常温离心15 min；上清液转入新的2.0 mL离心管中。加入1/2体积5 mol/LNaCI的溶液，混匀后再加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混