一种培养松材线虫快速简易方法.docVIP

一种培养松材线虫的快速简易方法 　　摘 要：松材线虫病是松树的一种毁灭性病害，致死率高，传播快，治理难度大。松材线虫病的病原为松材线虫。传统的松材线虫培养方法一般用真菌，如灰葡萄孢、盘多毛孢等，还有人用高压灭菌的玉米粒接种真菌后培养松材线虫。但是食料真菌培养法其操作过程较为繁杂易污染，且难以排除食料真菌或消毒剂对实验的影响。本文首次用高压灭菌的马尾松木块培养松材线虫，快速简单，并且获得的松材线虫保存和使用方便，为进一步研究松材线虫病的机理和防治方法提供了便利。 　　关键词：松材线虫;培养;灭菌木块 　　 松材线虫病又称松树萎蔫病，是松树上最严重的病害，对松树的危害是毁灭性的，因此它也是我国重要的检疫对象之一[1-6]。松材线虫病致病力强，寄主死亡速度快;传播迅速，常常猝不及防;一旦发生，治理难度大。它不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生态环境，对中国丰富的松林资源构成严重威胁。松材线虫病的病原为松材线虫。有关松材线虫病的研究一般首先从松材线虫的分离和培养开始。有关松材线虫的培养，国内外都有报道。Mamiya等首次用灰葡萄孢（Botrytis cinerea）菌丝体繁殖松材线虫[7]。我国普遍采用的是灰葡萄孢和盘多毛孢菌（Pestalotia sp. ）[1，2]培养松材线虫。曾永三等报道用长喙壳菌（Ceratocystis sp.）、毛壳菌（Chaelomium sp.）和镰刀菌（Fusarium sp.）培养松材线虫效果更佳[8]。另外，贲爱玲等使用玉米粒接种灰葡萄孢来培养松材线虫取得良好效果[9]。但是食料真菌培养法其操作过程较为繁杂易污染，且难以排除食料真菌或消毒剂对实验的影响[10]。本研究首次用高压灭菌的马尾松木块培养松材线虫，并取得良好效果，探寻出了一种更简单易行的松材线虫培养方法，为进一步研究松材线虫病的机理和防治方法提供了便利。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 马尾松健康木。来源于浙江杭州 　　1.1.2 松材线虫。松材线虫由漏斗法分离，自浙江舟山的感病马尾松中获得。 　　1.2 研究方法 　　1.2.1 马尾松健康木的处理。选取马尾松健康木，将其切割成2.5cm×2.5cm×5cm的长方体小块，每个木块上钻一小孔以便接入线虫液[11]。将木块置于可高压灭菌的玻璃杯（或者组培用的培养瓶）中，高压灭菌30分钟。 　　1.2.2 线虫液的处理。将松材线虫液进行表面消毒[1]。本试验中线虫液的浓度为：4000头/0.5ml。线虫种群情况为：0.5ml线虫液中，2龄、3龄、4龄、雌虫和雄虫分别为480条、950条、1640条、830条和100条，其中幼虫3070条，成虫930条，幼虫所占的比例为76.75%，性别比为8.3：1。 　　1.2.3 接种线虫。将线虫液摇匀，在超净台上，用消毒好的吸管或者灭菌的加样枪吸取线虫液0.5ml接种到灭菌木块的小孔里。把培养瓶放入25℃的培养箱中繁殖线虫[8]。 　　1.2.4 松材线虫的分离。接种松材线虫22天以后，每天取出4瓶（4个重复），连续取样8天。取样后，将木块劈成3mm左右的木片，贝尔曼漏斗法分离木块中的松材线虫，同时也分离瓶壁和封口膜上的松材线虫。 　　2 结果与分析 　　 接种线虫22天以后，每天取样4瓶，将木块、瓶壁和封口膜上分离到的线虫液混合，稀释到合适的浓度，在显微镜下计算虫量和繁殖倍数，连续计数8天。松材线虫计数结果和繁殖倍数如表1和图1所示。结果表明，用灭菌马尾松木块是可以培养松材线虫的。取样第1天，松材线虫数量最多，最大繁殖倍数为32.9倍;取样最后一天，松材线虫数量最少，最小繁殖倍数为10.7倍。在取样的8天里，松材线虫数量呈下降趋势。 　　3 讨论 　　3.1 马尾松木块培养松材线虫简单易行 　　 传统的松材线虫培养方法，如用真菌或者玉米粒等食料真菌法培养松材线虫，其操作过程较为繁杂易污染，且难以排除食料真菌或消毒剂对实验的影响。无异活体培养法其培养周期较长，产量较低，而且长期培养还可能会改变松材线虫原有的生物学特性[10]。而用灭菌的马尾松木块培养松材线虫，操作程序简单，短时间内能获得大量线虫，而且不受真菌食料影响和污染。另外，目前常用的食料真菌培养法培养松材线虫，需要首先接入真菌，等真菌长满整个平皿以后才能接入松材线虫，这大约需要1周左右的时间，而用灭菌的木块培养松材线虫不需要接入真菌，所以能够缩短松材线虫的培养时间。 　　3.2 马尾松木块培养的线虫保存方便，活力强 　　 从真菌或玉米粒上滤出的线虫液用平皿或者锥形瓶置于冰箱中保存的时间较短，容易造成线虫生活力降低甚至死亡。而用灭菌的马尾松木块培养的线虫，既可以将已经