一种提取小型昆虫总RNA有效方法.docVIP

一种提取小型昆虫总RNA的有效方法 　　摘　要　实验采用SDS，乙酸钾(KAc)等常规化学试剂从蚜虫等小型昆虫中获得完整且纯度较高的RNA。进一步的实验证明提取的RNA可用于RT-PCR以及cDNA文库的建立等。该方法简捷、相对安全和快速、提取效率较高，适合于中小型昆虫RNA的提取。 　　关键词　小型昆虫，RT-PCR，RNA提取 　　 　　许多昆虫个体较小，RNA含量较少，提取困难。目前市场上针对于昆虫而开发的RNA提取试剂很少，而且多数采用Trizol等氧化性较强的试剂，常配合有毒试剂如氯仿的使用，并且要求提取前昆虫量较大。本实验参照热酚法和SDS-KAc法提取RNA做了适当改进，改进后的方法能够简捷、相对安全和快速地从小型昆虫中提取到完整的、DNA污染很少的RNA，而且提取效率较高。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　材料 　　桃蚜Myzus persicae(Sulzer)、烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)和西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergands)的成虫采于中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室内，用70％的酒精(DEPC水配制)－20℃保存。 　　 　　1．2　提取方法及试剂 　　1．2．1　提取试剂：十二烷基硫酸钠(SDS):BIOBASIC INC；Tris-HCl(pH=8.0)、乙二胺四乙酸(EDTA)、0.05％的焦碳酸二乙酯(DEPC)：北京科昊达生物技术发展有限公司；蛋白酶K(20mg/mL，TIANGEN)酸性饱和酚(pH＜5.0)：北京鼎国生物技术有限公司；NaCl、醋酸钾(KAc)、异丙醇及乙醇：北京化工厂。 　　1．2．2　裂解液的配制及乙酸钾pH值的调节：裂解液：2％SDS，1mol/L Tris-HCI(pH8.0)，5mol/L NaCl，0.5mol/L EDTA，DEPC水，3mol/LKAc(pH4.8)(配制时用冰醋酸调节，热浴可以加快KAc在乙酸中的溶解)。 　　1．2．3　提取方法：(1)取桃蚜／烟粉虱／蓟马的成虫于DEPC水中漂洗，然后用处理过的吸水纸吸干。 　　(2)用DEPC处理过的昆虫针将桃蚜／烟粉虱／蓟马挑至1.5mL的离心管中，加入30μL上述配置好的裂解液，整个过程在通风橱中进行。 　　(3)然后用预先烧好的封顶枪头将昆虫捣碎，捣碎完毕后再加入60μL裂解液，将枪头上的残余冲洗。 　　(4)加入10μL KAc(pH4.8)，用枪头混匀，使溶液终浓度为0.3mol/L。 　　(5)加入100 uL饱和酸性酚，剧烈振荡5～15s。 　　(6)加入3μL蛋白酶K，在水浴锅中55～65℃恒温热浴5～10C后放置冰上10min左右(热浴时间和冰浴时间视虫量而定)。 　　(7)从冰上取出，在冷冻离心机下4℃12000r/min离心10V。 　　(8)取上清夜于另一1.5mL离心管中，加入等体积的饱和酸性酚，来回颠倒后在4℃12000r/min离心10min(注：虫量较小时此步可省略)。 　　(9)取上清液于另一1.5 mL离心管中，然后加入等体积的异戊醇或无水乙醇，-20℃下放置15～30min。 　　(10)4℃12000 r/min离心10min。 　　(11)弃上清后加入75％的乙醇洗涤沉淀，常温下13000r/min离心1min，尽量去除乙醇残留，重复2～3次。 　　(12)放置于通风橱中自然干燥，注意RNA沉淀不能完全干燥。 　　(13)加入配制好的无RNAase的TE溶液10μL于离心管中。 　　(14)保存于－70℃冰箱内。 　　 　　1．3　紫外分光光度计和琼脂糖检测 　　从每管中取出1μL，加无RNasc的TE水至100μL混匀后，测定其260、280nm的吸光度，并根据A260/A280的比值评估RNA的纯度(正常范围：1.8～2.0)。另取3～4μL用于琼脂糖电泳检测RNA的完整性。 　　 　　1．4　RT-PCR反应检测RNA的质量 　　取1μL提取的蚜虫RNA溶液，逆转录后作为cDNA模板，然后选取1对简并引物sa.acel(由上海生工合成)扩增桃蚜的AChE基因，逆转录?疾捎?TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒，PCR反应步骤参考陈茂华的体系做适当调整，1.2％琼脂糖电泳鉴定PCR产物，溴化乙锭染色，紫外灯下观察电泳结果。 　　 　　1.5　RNA提取效率比较 　　采用了rizol(Invitrogen公司)试剂按照RNA提取说明书和改进后的SDS-KAc-热酚法提取单头烟粉虱的RNA，提取后检测其纯度、完整性等。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2．1　RNA