不同氨基酸对雷公藤不定根生长及次生代谢产物含量影响.docVIP

不同氨基酸对雷公藤不定根生长及次生代谢产物含量的影响 　　[摘要] 以雷公藤不定根为材料，通过在MS培养基中添加不同浓度的天冬氨酸，异亮氨酸，半胱氨酸和精氨酸，研究其对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响。结果表明：第3周添加0.25 mmol?L-1天冬氨酸时，虽然不定根增长量为对照的80%，但不定根及培养液中雷公藤内酯醇含量分别为对照的1.36，1.3倍，雷公藤吉碱含量分别为对照的1.16，1.37倍，雷公藤次碱的含量分别为对照的1.22，1.63倍。第3周添加0.05 mmol?L-1的异亮氨酸时不定根增长量为对照的97.3%，不定根及培养液中雷公藤吉碱分别为对照的1.02，1.27倍，雷公藤次碱的含量分别为对照的1.36，1.15倍。第1周添加0.25 mmol?L-1半胱氨酸时，不定根增长量仅为对照的77.5%，但不定根中雷公藤内酯醇含量为对照的1.87倍。第2周添加1.00 mmol?L-1半胱氨酸时，培养液中雷公藤次碱含量为对照的2.97倍。在第3周精氨酸浓度为0.5 mmol?L-1时，不定根增长量为对照124.2%，雷公藤吉碱和次碱的含量分别为对照的1.3，1.4倍。 　　[关键词] 雷公藤；不定根；组织培养；氨基酸；次生代谢产物 　　雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.为卫矛科雷公藤属多年生木质藤本植物，在我国主要分布于长江流域以南各地及西南地区。其根部所含的次生代谢产物雷公藤内酯醇（雷公藤甲素），具有抗炎、抗类风湿、抗肿瘤、抗HIV及治疗老年性痴呆症等功效，临床上常用于治疗红斑狼疮，慢性肾炎，皮肤病，白血病以及多种自身免疫性疾病[1-4]，作为生物农药，雷公藤内酯醇具有触杀、胃毒、拒食等作用[5-6]。雷公藤生物碱具有杀虫谱广、作用方式多样、杀虫效果较好等优点[9-10]。其中，雷公藤次碱、雷公藤春碱等具有明现的体液免疫抑制作用[8]。然而雷公藤自然生长较慢，多年来大量采挖，造成野生资源稀少，无法满足市场需求[10-11]，寻求其他方法来解决这一问题越加紧迫。通过前期试验发现，雷公藤悬浮细胞培养所含的次生代谢产物含量较低，相比较悬浮细胞不定根具有生长速度快、次生代谢产物含量高，并且雷公藤内酯醇和雷公藤生物碱均为分泌型成分，培养不定根后每瓶培养液中雷公藤内酯醇和雷公藤生物碱的含量远远超过了不定根中的含量等优点[12-14]。雷公藤生物碱主要是倍半萜吡啶生物碱，由倍半萜和生物碱通过酯化反应生成，Liao认为倍半萜吡啶生物碱中吡啶部分和倍半萜部分生物合成途径中，天冬氨酸，异亮氨酸，烟酸等参与了吡啶部分的生物合成[15]。为了提高雷公藤不定根中雷公藤内酯醇，雷公藤生物碱等主要次生代谢产物的含量，本试验研究了不同培养时间添加不同浓度的氨基酸，对雷公藤不定根的生长以及次生代谢产物含量的影响。 　　1 材料 　　雷公藤不定根为本实验室经过多代继代培养保存的材料。 　　高效液相色谱仪（Waters 600E，Milford，USA）、Waters 2478紫外检测器。雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱对照品由上海同田生物技术有限公司提供。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。 　　2 方法 　　分别将天冬氨酸，异亮氨酸，半胱氨酸，精氨酸溶解于无菌水，配成1.0 mmol?L-1的母液，调节其pH至5.8，并在超净工作台中用0.22 μm滤膜过滤除菌。继代培养的雷公藤不定根生长至第1周，第2周，第3周时，在培养基中分别添加0.05，0.25，0.50，1.00 mmol?L-1的4种氨基酸，每个浓度至少3个重复。培养至第30天收获不定根及培养液。用适量去离子水将不定根上残留培养基冲洗干净，于60 ℃烘箱干燥至恒重，计算不定根增长量（收获量-接种量），粉碎过100目筛，保存于4 ℃冰箱供雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱含量的测定。 　　以上培养基均为MS+4.0 mg?L-1 NAA+0.5 mg?L-1 KT，加入蔗糖30 g?L-1，250 mL三角瓶内装100 mL培养基，接种密度为15～20 g ?L-1，pH用PHS-2C型酸度计于高压灭菌前调至5.8～6.0，培养条件为温度（25±1） ℃，自然光照，摇床转速为120 r?min-1。 　　雷公藤不定根及培养液中雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的提取及含量测定参照文献[13]的方法。 　　采用SPSS软件对（Version 16.0）对试验所得数据进行NAOVA方差分析，采用Duncan′s新复极差法检验数据之间的差异显著性。 　　3 结果与分析 　　3.1 天冬氨酸对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响 　　3.1.1 天冬氨酸对雷公藤不定根生长和不定根中次生代谢产物含量的影响