不同氮源对海洋真菌BH0531发酵液杀线虫活性影响.docVIP

不同氮源对海洋真菌BH0531发酵液杀线虫活性的影响 　　摘要：海洋来源的枝顶孢霉（Acremnium，BHO531）是一株以松材线虫为靶标筛选出的杀线虫真菌。氮源的化合态和种类对该菌株的生长以及代谢产物的活性有显著影响。研究结果显示，不同氮源对菌体生长量的影响差异显著，有机氮优于无机氮；代谢物的杀线虫活性则表现为无机氮优于有机氮，其中以NaNO3为氮源的发酵液对松材线虫的杀线率以及NH4cl为氮源的发酵液对根结线虫的杀线率分别高达95.67%和96.60%，均高于有机氮源中最高的蛋白胨。根结线虫对各种无机氮源发酵液的敏感性普遍高于松材线虫。此外，经高温处理的代谢物仍观察到较强的杀线虫活性，显示出良好的热稳定性。 　　关键词：海洋枝顶孢霉；氮源；杀线活性；松材线虫；根结线虫 　　中图分类号：Q939.9；5；432.4.5 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0121-03 　　植物寄生线虫是一类世界性分布的重要植物病原物，其寄生范围广，环境适应性强，几乎每种作物都受到植物线虫的侵害，其危害程度仅次于真菌，已超过细菌、病毒，成为第二大植物病害，防控形势严峻。真菌杀线剂（具杀线活性的代谢产物）是一类环境友好型生防因子，越来越受到广泛重视。已经报道的具有杀线虫活性的真菌种类超过700种，已分离得到的杀线虫活性代谢产物多达230余种。这些杀线虫真菌及其代谢物的研究主要集中在陆生性真菌（包括病原菌和内生真菌），如淡紫拟青霉活菌剂和总状共头霉（Srl8菌）等。海洋来源的枝顶孢霉（Acremnium，BHO531）是一株已被证实具有较好杀线虫作用的海洋真菌。不同于陆生性真菌，该菌在添加海水的培养基中的生长情况和杀线虫活性均优于普通察氏培养基，且其代谢活性物具有含氮化合物属性；因此，探究不同化合态的氮源对该菌在察氏培养基生长及其代谢物杀线虫活性的影响，将有助于活性代谢产物发酵条件的优化，克服海水高盐组分对发酵设备的影响。据此，本试验以松材线虫、黄瓜根结线虫二龄幼虫（.T2）为对象，以杀线虫效果（杀线率）为指标，测定了NaNO3、KNO3NH4NO3、（NH4），SO4、NH4Cl等不同氮源对BH0531菌株生长状况及其活性代谢产物的影响，旨在为进一步优化该菌的发酵条件提供试验依据。 　　1.材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1供试菌株海洋枝顶孢霉（Acremnium，BHO531），菌种保藏号CGMCC-5445；灰葡萄孢霉（Batrytisnerea，BC菌），以上菌种由天津师范大学生命科学学院微生物实验室提供。 　　1.1.2供试线虫松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus），中国农业科学院植物保护研究所提供；黄瓜根结线虫（Meloido-gyneincognita）取白天津市宝坻区黄瓜大棚基地。 　　1.1.3供试培养基（1）活化培养基：去皮马铃薯200g/L煮汁，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，蒸馏水定容至1000mL；用于活化BH0531菌株。（2）发酵培养基：2g/L氮源，1g/LKH2O4，0.5g/LMgSO40.5g/LKCl，0.01g/LFez（SO4）3?5H2O，20g/L葡萄糖，pH值自然。氮源分别为NaN0，、KNO3、NH4NO4、（NH4）：SO4、NH4C1、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏。（3）大麦仁培养基：10g大麦仁，8mL去离子水，大试管浸泡3～6h，灭菌，用于BC菌培养。 　　1.2试验方法 　　1.2.1BH0531菌株的培养将保藏的BHO531菌种接种至活化培养基斜面试管，26qC培养5～7d。 　　1.2.2灰葡萄孢霉的培养 　　将灰葡萄孢霉接人大麦仁培养基，21℃生化培养箱内培养7d，用于松材线虫的培养。 　　1.2.3 　　松材线虫的培养将松材线虫接种于培养好的BC菌上，25℃下避光培养7d；通过贝尔曼漏斗法收集松材线虫，制备成浓度为10000条/mL的线虫悬液。1.2.4黄瓜根结线虫二龄幼虫（J2）的制将大田取得的黄瓜病根剪成1cm小段；在1%次氯酸钠溶液中漂洗4min，再在匀浆机里搅拌2min；利用100目、300目和500目的网筛冲洗并收集虫卯。再将卯收集到的离心管中，在底部加入40%蔗糖溶液，3500r/min密度梯度离心5min。之后吸取界面溶液过500目网筛，反复冲洗收集卯。将上述收集得到的卯置于已消毒的培养皿中，垫上湿润滤纸，25qC下孵化4d。 　　1.2.5发酵液的制取活化的BHO531菌株斜面，加入无菌水洗脱孢子，制备浓度为2×10。CFU/mL的孢子悬液，以1%的接种量分别接入不同氮源发酵培养基中，26℃、120r/min培养96h。发酵菌液经离心除菌（6000r/min30min