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不同生长年限园参根的双向电泳分析 　　doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.019 　　摘要：为了解园参根在生长过程中的蛋白质组学变化，利用双向电泳技术分离1～5年园参根蛋白，重点分析园参根生长（3年）、成熟（5年）之间的蛋白质组学差异，并利用MALDI-TOF/TOF鉴定差异显著的81个蛋白点。结果表明：有19个差异蛋白点在成熟期表达量下调，62个蛋白点表达量上调，针对其与园参根生长发育的潜在关系进行分类与讨论；园参根在逐渐成熟的过程中与抗胁迫相关的过氧化氢酶、单脱氢抗坏血酸还原酶等，以及与能量代谢相关的ATP酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等表达量增加，而与生长相关的果胶酯酶表达量减少，这些蛋白质的变化对于探讨人参根的生长发育规律有重要意义。 　　关键词：园参；生长年限；双向电泳；蛋白质组学 　　中图分类号：S567.5+10.1文献标志码：A文章编号：1002-1302（2016）10-0084-04 　　收稿日期：2015-09-02 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；吉林省教育厅科学技术研究项目[编号：吉教科合字（2014）第193号]；吉林省科技计划（编号：20150520138JH、20130522045JH、20140519016JH、YYZX201268）。 　　作者简介：麻锐（1982―），女，吉林吉林人，博士，讲师，主要从事人参蛋白质组学研究。E-mail：maruijilin@163.com。 　　通信作者：冯凯，硕士，讲师，主要从事植物生物科学研究。E-mail：fengk544@163.com。人参（Panax ginseng C A May，Araliaceae）为五加科多年生草本植物，其根部作为补气圣品，有悠久的药用历史。人参的品质多受其生长年限的影响，需要生长5年以上才可收获药用。研究表明，人参根中含有多种皂苷、挥发油、多糖、蛋白质等物质，具有调节中枢神经系统、促进大脑对能量物质的利用、改善心脏功能、降低血糖、增强人体免疫力、抗肿瘤等作用[1]，并且这些物质含量会随着参龄的增长而递增，进入成熟期（5年）后趋于稳定[2-3]。也就是说，进入成熟期的人参质量好，药效价值显著，并且在这过程中的生理生化转变皆可由基因调控的蛋白质差异表达而得以反映。因此，研究人参根生长期与成熟期的蛋白质组学变化对于揭示人参生长发育特性有重要意义。 　　近年来，随着蛋白质组学的快速发展，高通量、高灵敏度的双向电泳和质谱等蛋白质组学技术已经可以快速鉴定上千种蛋白质，为监测植物生长代谢过程中蛋白质的动态变化提供了可能。本研究应用比较蛋白质组学技术，建立不同生长年限园参的蛋白质表达图谱，分析其差异表达蛋白的功能，探讨园参参根的生长发育规律，对认识园参药效形成有一定意义。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　75株试验样品采自吉林省抚松县露水河镇，分别为1、2、3、4、5年生园参各15株。新鲜园参用超纯水洗净后，切成碎块，用液氮研磨成精细粉末后存于-80 ℃备用。 　　1.2蛋白提取 　　园参根蛋白质的提取方法采用改进后的酚提法[4]。取0.2 g液氮研磨的园参根粉末，加入7倍体积、含0.07% β-巯基乙醇的丙酮溶液（-20 ℃预冷），-20 ℃静置1 h后，于4 ℃、15 000 r/min离心15 min，弃上清，重复3次；将沉淀置于 4 ℃ ，待丙酮完全挥发后，加入4倍体积样品裂解液{含 7 mol/L 尿素、2 mol/L硫脲、2% 3-[（3-单酰胺丙基）-二乙胺]-1-丙磺酸（CHAPS）、1%植物蛋白抑制剂}，旋涡混匀，100 W超声40 min后，于15 000 r/min、4 ℃离心 15 min，收集蛋白上清液；加入等体积Tris-饱和酚（pH值=7.8）振荡30 min，于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取中层、下层，加7倍体积含0.1 mol/L乙酸铵的甲醇溶液沉淀过夜，于4 ℃、15 000 r/min离心15 min，弃上清；沉淀用含 0.1 mol/L 乙酸铵的甲醇溶液洗涤2遍，再用预冷的丙酮洗涤3遍，将沉淀物干燥，于-80 ℃贮存。参照Bradford的方法进行蛋白质定量[5]。 　　1.3双向电泳（2-DE） 　　取1 000 μg蛋白，加入再水化液[含5 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、2% CHAPS、2%磺基三甲基胺乙内酯3-10（SB3-10）、0.65% pH值3～10固相pH值梯度缓冲液（IPG buffer）、0.35% pH值4～7固相pH值梯度缓冲液（IPG buffer）][6]至终体积450 μL。等电聚焦采用24 cm、pH值3～10预制干胶条（GE