不同直径卵泡对绵羊卵母细胞体外发育能力影响.docVIP

不同直径卵泡对绵羊卵母细胞体外发育能力的影响 　　摘要：以屠宰场绵羊卵巢为材料，采用抽吸法收集小卵泡、中卵泡、大卵泡卵母细胞，研究不同卵泡直径对卵母细胞回收效果、比例分布以及对卵母细胞直径、谷胱甘肽（GSH）含量和体外发育能力的影响。结果表明，3种卵泡卵母细胞比例分布差异极显著（P0.05），但中、大卵泡卵母细胞可用率极显著高于小卵泡卵母细胞（P005）。因此，直径≥2 mm的卵泡的卵母细胞适合体外培养和体外胚胎的生产。 　　关键词：卵泡直径；绵羊；卵母细胞；孤雌激活 　　中图分类号： S826.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0141-04 　　随着哺乳动物体外受精、克隆、转基因等生物技术研究的不断深入，对动物卵母细胞的数量、质量要求越来越高。目前，胚胎体外生产（in vitro production，IVP）的卵母细胞主要来源于屠宰场收集的卵巢，由于屠宰动物的年龄及卵巢表面卵泡的大小等存在差异，培养后获得的胚胎质量也有很大差异[1]，一般收集的卵泡卵母细胞囊胚率都很低[2]。与体内自然成熟的卵母细胞相比，体外培养的卵母细胞成熟率、受精率和早期胚胎发育能力呈现不同程度的下降趋势。在体内，卵母细胞在卵泡内发育成熟，作为卵母细胞的生长环境，卵泡的大小对卵母细胞的成熟和后期发育潜力起着至关重要的作用[3]。Crozet等早期报道，不同直径卵泡中的卵母细胞发育能力不同，所以研究卵泡大小对后期发育潜力的影响十分必要[4]。目前，国内外很多研究者只报道了山羊[5-6]、牛[3]的卵泡大小对卵母细胞发育的影响，且国内还未见对绵羊的报道。本研究分析卵泡直径对卵母细胞的回收效果、比例分布以及对卵母细胞直径、谷胱甘肽（GSH）含量和体外发育能力的影响，以期为胚胎工程中卵子的来源和选择提供基础依据，并提高体外生产胚胎的水平。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 药品及试剂 本研究所用化学试剂除特殊说明外均购自Sigma公司；培养用胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA）购自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Bovogen公司。 　　1.1.2 卵巢采集 卵巢采集于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市华凌屠宰场。母羊屠宰后立即剖腹取出卵巢，置于37～38 ℃含青霉素、链霉素（双抗）的生理盐水中，2～3 h内送至实验室；用约38.5 ℃、含有双抗的生理盐水洗涤2～3次，以灭菌的吸水纸吸干后，用带9号针头的吸有1～2 mL抽卵液的10 mL注射器分别抽取5 mm（大卵泡）的卵泡中的卵泡液；分别在体式镜下挑选出卵丘细胞包裹3层以上、结构致密的卵母细胞-卵丘细胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs），移入抽卵液中洗3次。 　　1.2 方法 　　1.2.1 卵母细胞的体外成熟培养 将各组卵母细胞分别用抽卵液洗涤3次后，再用体外成熟（in vitro maturation，IVM）液洗涤3次，按20～30枚/滴移入100 μL提前5～6 h平衡好的IVM液滴内，在38.6 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行成熟培养。液体配制如下：抽卵液：Hepes-199+2%FBS+ 6 U/mL 肝素钠+100 U/mL双抗；IVM：TCM199+0.05 U/mL FSH+10%FBS+1 μg/mL雌激素+10 ng/mL EGF+0.1 mmol/L半胱胺酸+24.2 mg/mL丙酮酸钠+100 U/mL双抗。 　　1.2.2 去除卵丘细胞 卵母细胞成熟培养22～24 h后，将卵母细胞在含0.1%透明质酸酶的Hepes-199中用吸管反复吹打去除全部卵丘细胞，在体视镜下挑出排出第一极体的卵母细胞用于后期培养，并统计体外培养成熟率。 　　1.2.3 卵母细胞孤雌激活 挑选出有极体且细胞质均匀的卵母细胞在含5 μmol/L离子霉素（ionomycin）的激活液中激活4 min，经2 mmol/L 6-DMAP培养液洗2次后，移入含 6-DMAP 的培养液内培养2 h，培养液洗涤3次后移入含有 600～700 μL 体外培养液的四孔培养板中培养，CO2箱培养条件为38.6 ℃、5%CO2、5%O2、90% N2及饱和湿度，培养 48 h 后统计卵裂率，培养6～8 d统计囊胚率。 　　1.2.4 囊胚Hoechst细胞染色 取7 d的囊胚，将囊胚转移到含10 μg/mL Hoechst33342的抽卵液内避光孵育7～10 min，再将囊胚转移到载玻片上，尽量少带液体，盖上盖玻片，用凡士林封片，在倒置显微镜的紫外光下进行细胞计数。 　　1.2.5 数据统计 数据采用SPSS 13.0统计软件的 One-way ANOVA方法进行分析。 　　2 结果与分析