不同方法分离大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性和成脂分化能力比较.docVIP

不同方法分离的大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性和成脂分化能力的比较 　　肖　斌 　　[摘要]目的：通过比较密度梯度离心和贴壁筛选两种方法所获MSCs的增殖活性和成脂分化能力，探索MSCs体外分离和纯化的较好方法。方法：应用密度梯度离心和贴壁筛选两种方法分离纯化骨髓MSCs，并通过MTT法检测其增殖活性，用第三代MSCs进行成脂诱导，以观察两种方法所获MSCs的成脂分化能力。结果：密度梯度离心法所获MSCs纯度高，呈纺缍形或小三角形，增殖快，约7～10天融合：贴壁筛选法分离的原代细胞中红细胞。破骨细胞等杂质细胞较多，增殖速度相对较慢，且经数次传代仍有较多杂质细胞存在，经成脂诱导后，两种方法所获MSCs表现出相似的成脂能力，油红O染色细胞计数值与光密度值比较两组无显著差异(P值0．05)。结论：密度梯度离心法是体外分离和纯化MSCs较好的方法，所获细胞增殖活性高，与贴壁筛选法所获MSCs具有相似的成脂分化能力。 　　[关键词]骨髓间充质干细胞；细胞培养；成脂分化；组织工程 　　[中图分类号]Q2－06　[文献标识码]A　[文章编号]1008―6455(2007)01－0021－04 　　 　　骨髓间充质干细胞(mesenchy mal stem cell，MSCs)具有来源广泛，容易获取，创伤小，无免疫排斥反应，细胞处于未分化状态，增殖能力强，易于培养和自体移植，不存在伦理、道德和法律争议问题，克服了胚胎干细胞的弊端，其所具有的独特优势在组织工程研究中具有广阔的应用前景。MSCs可以直接从自体骨髓腔抽吸或松质骨获得，可作为组织工程中构建组织的种子细胞。MSCs常用的分离方法有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法。由于流式细胞仪分选法步骤比较繁琐，现在分离MSCs最常用的方法是贴壁筛选法和密度梯度离心法。本研究采用密度梯度离心法和贴壁法分离MSCs，并进行体外培养，通过比较所获得MSCs的细胞纯度、增殖活力及成脂能力，以寻求一种较为理想的体外分离、纯化与培养MSCs的方法。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1材料：实验动物为体重(100+20)g的2月龄雄性SD大鼠(兰州军区兰州总医院实验动物科)。MEM(Gibco BRL公司)，胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，IBMX(Sigma公司)，CO2恒温培养箱(Heracell，德国)，超净工作台(杭州净化有限公司)，倒置相差显微镜(Olympus公司)。 　　1．2方法 　　1．2．1大鼠MSCs的分离、纯化1．2．1．1贴壁法：将SD大鼠拉颈处死，75％酒精浸泡15～20min，无菌条件下取胫骨和股骨，将其两端干骺端切除，显露骨髓腔，用含10％FBS的MEM彻底冲洗骨髓腔，无菌注射器反复吹打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散制成单细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度，按2×109／cm2密度置于培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中培养。 　　1．2．1．2密度梯度离心法：取骨髓方法同上，将所获骨髓单细胞悬液800×g离心5min，去除上部的脂肪层，将余下部分加入含有1．073g/ml的percoll分离液中2500×g离心25mim；吸取中间层的单个核细胞，用培养基MEM洗涤2次，重新悬起细胞，细胞计数，调整细胞密度后，按2×109／cm2,置于培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中培养。 　　1．2．2细胞传代：细胞长至70％～80％融合时，以0．25％的胰蛋白酶消化，1×105／cm2密度进行接种。1．2。3增殖特性：取第1代细胞培养，经0．25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，按1×105细胞／孔接种于96孔板。从接种后第1天起分别于第1．3．5．7．9．11天取6个时间点用MTT法检测细胞增殖活性。用酶标仪在630nm波长下检测每孔的光吸收值(OD)，并绘制生长曲线。 　　1．2．4定向诱导大鼠MSCs向脂肪细胞分化：细胞接近完全融合后，加入含1μmol／L的地塞米松，0．5mmol／L的IBMX，1μmol／ml的人胰岛素，1μmol／ml吲哚美辛，10％FBS的MEM(诱导培养液)培养3～4天换液。 　　1．2．5特异性脂肪细胞染色鉴定：爬片细胞用PBS冲洗2遍，10％福尔马林固定30 min，60％异丙醇固定30min，油红O染液1h，60％异丙醇固定30min，蒸馏水冲洗弃液，显微镜下观察拍照，随机记数10个非重复视野内脂肪细胞占总细胞数的比例。 　　1．2．6油红O染色定量：将P3代长至接近完全融合后加入含脂肪诱导剂的培养液，第14天油红O染色(方法同上)后用蒸馏水冲洗后吹干，各培养皿加入同等量的异丙醇，充分震荡摇匀后，将液体离心取上清放入比色杯中进行光吸收值测定，通过光密度值推断脂肪细胞的数量。