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不同水稻受体材料对洁净DNA转化效率的影响 　　摘要：选取不同诱导条件（28 ℃光照、28 ℃黑暗、32 ℃光照、32 ℃黑暗），不同继代次数初代培养、1次继代培养、2次继代培养的愈伤组织，分别作为转化受体材料，研究不同受体材料对洁净DNA转化效率的影响。结果表明，32 ℃光培养诱导的愈伤经过1次继代后作为转化受体材料，得到的转化效率最高，达到9.32%。 　　关键词：水稻；受体材料；洁净DNA转化；转化效率 　　中图分类号： Q943；S511.03文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0043-04 　　收稿日期：2013-09-11 　　基金项目：浙江经贸职业技术学院科研课题（编号：13QN08）。 　　作者简介：赵潇（1987―），女，浙江东阳人，硕士研究生，助教，主要从事植物基因工程与分子生物学研究。Tel：（0571E-mail：zhaoxiao413@126.com。 传统的遗传转化中，普遍使用完整质粒DNA，非目的基因的质粒载体主干序列经常随着目的基因整合到植物基因组中，并通过形成稳定的次级结构，产生重组热点或导致异常重组，重组产生的基因多拷贝经常导致转基因的低表达甚至基因沉默[1]。基因枪介导的洁净DNA转化技术是直接将外源基因表达框线性DNA导入植物基因组中，所得不含非目的基因的DNA序列，获得安全的转基因植株[2]。基因枪转化的受体材料，所处的生理状态不同，接受外源DNA的能力也不同。一般认为生理活性高的组织或细胞有利于DNA的摄入与整合[3]。选用再生能力强的外植体为转化受体，将有利于转化频率的提高。本研究主要选取不同诱导条件，不同继代次数的愈伤组织，分别作为转化受体材料，将含bar基因的表达框，通过基因枪法导入水稻，以期明确不同水稻受体材料对洁净DNA转化效率的影响。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　供试材料为粳稻日本晴，由中国水稻研究所水稻生物学重点实验室种质创新课题组提供。 　　1.2基因 　　含有bar基因的载体质粒为pCB1，pCB1质粒菌保由中国水稻研究所水稻生物学重点实验室种质创新课题组提供。pCB1质粒大小为6.91 kb，结构如图1所示。 　　1.3培养基 　　试验中所需的培养基见表1。 　　1.4水稻愈伤组织诱导 　　1.4.1不同条件下诱导的愈伤组织挑选籽粒饱满的日本晴成熟种子，粗糙去壳，再挑选胚完整而无裂纹的种子，用70%的乙醇浸泡60 s，再用体积分数30%次氯酸钠溶液（有效氯≥5%）中浸泡15 min，重复该操作1次，用无菌水冲洗 3～5 次，再将种子置于灭菌的垫有滤纸的培养皿中于超净台上吹干，然后接入NB培养基中，在28 ℃光照、28 ℃黑暗、32 ℃ 光照、32 ℃黑暗4种条件下诱导愈伤。待长出可见的芽和愈伤后，将芽掐掉，愈伤朝上继续培养2周，2周之后，将有活力的愈伤移入新NB诱导培养基继代培养15 d，15 d后挑出颜色鲜黄、表面光滑，直径大小约为3 mm左右的愈伤组织颗粒，作为基因枪转化的受体材料。 　　1.4.2不同继代次数的愈伤组织挑选籽粒饱满的日本晴成熟种子，粗糙去壳，再挑选胚完整而无裂纹的种子，用70%的乙醇浸泡60 s，再用体积分数30%次氯酸钠溶液（有效氯≥5%）中浸泡15 min，重复该操作1次，用无菌水冲洗3～5次，再将种子置于灭菌的垫有滤纸的培养皿中于超净台上吹干，然后接入NB培养基中，在32 ℃光照条件下诱导愈伤。待长出可见的芽和愈伤后，将芽掐掉，愈伤朝上继续培养2 　　表1水稻组织培养基 　　培养基成分诱导、继代NB培养基+2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸 pH值5.8预分化培养基NB基本培养基+5 mg/L 脱落酸+2 mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.5 mg/L 萘乙酸 pH值5.8分化培养基NB基本培养基+3 mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.5 mg/L 萘乙酸+13g/L山梨醇+50 mg/L羧苄青霉素 pH值5.8生根培养基1/2MS基本培养基+20 g/L蔗糖+2mg/ml 多效唑 pH值5.8MS大量、MS微量、B5有机、Fe-EDTA、30 g/L蔗糖MS基本培养基2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、300 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L 肌醇3 g/L植物凝胶 pH值5.8高渗培养基NB培养基+2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+47 g/L甘露醇+47 g/L山梨醇 pH值5.8 　　周之后，将愈伤组织等分为3组，从1组中挑出颜色鲜黄、表面光滑、直径大小约为3 mm左右的愈伤组织颗粒，直接作为基因枪转化的受体材料。其余2组移入新的NB诱导培养基进行继代培养。15 d后，将继代培养的愈伤组织分为2组，1组进行第2次继代，另一组中挑取颜色