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不同浓度血通灵对人乳腺癌细胞侵袭作用及基质金属蛋白酶―9蛋白表达的影响 　　摘要：目的 探讨血通灵对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭转移作用机制。方法 Transwell侵袭实验检测不同浓度血通灵对细胞侵袭作用的影响，初步明确药物抗肿瘤转移的物质基础；应用明胶酶谱法检测血通灵对MDA-MB-231细胞分泌基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的影响；Western blot检测不同浓度血通灵干预后细胞中MMP-9蛋白表达的变化。结果 不同浓度血通灵均能显著抑制细胞分泌MMP-9能力、细胞侵袭能力和细胞内MMP-9蛋白表达，该抑制作用呈剂量依赖关系。结论 血通灵可能通过下调MDA-MB-231细胞中MMP-9蛋白表达而降低活性MMP-9的分泌，抑制细胞的侵袭能力。 　　关键词：血通灵；人乳腺癌细胞；侵袭作用；基质金属蛋白酶-9 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）01-0067-03 　　乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率和致死率已位居全球女性恶性肿瘤之首。侵袭和转移是恶性肿瘤最关键的生物学特性，是肿瘤细胞与宿主细胞相互作用并在多因子共同调控下的多步骤、多水平的复杂而精细的连锁过程。当原发肿瘤发生转移后，患者病死率大大提高。因此，肿瘤细胞侵袭转移是人类癌症彻底根治的一大重要障碍。中药复方以其靶点多、成分多、不良反应少等抗肿瘤特点，成为抗肿瘤药物研究的热点，中药复方可通过干预肿瘤细胞转移、诱导凋亡、调节机体免疫力、改善乳腺癌多药耐药性等方面发挥防治肿瘤的复发、转移，减轻手术及放化疗的毒副反应，改善生活质量等作用。中药复方血通灵具有活血化瘀、消肿散结、清热解毒、补肾滋阴等功效。本研究观察血通灵体外抗乳腺癌侵袭转移作用，探讨其作用机制，为该复方的进一步开发和利用提供实验依据。 　　1 实验材料 　　1.1 细胞 　　人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞均为单层贴壁细胞，购于美国ATCC细胞库。 　　1.2 药物及制备 　　血通灵由丹参、菊花、刺五加、桂枝、杜仲、葛根、红花、山楂、甘草、决明子、当归共11味药按一定比例组成，大连韩滨保健品公司提供。药材经粉碎成细粉状，采用自动煎药机制成水煎液，经减压浓缩，喷雾干燥后得干浸膏粉备用。称取一定量溶于PBS中配制成30 mg/mL储备液，应用0.22 μm滤膜滤过后于-20 ℃冰箱保存备用。 　　1.3 主要试剂与仪器 　　DMEM完全培养液，Hyclone公司；新生小牛血清，Hyclone公司）；胰蛋白酶，Hyclone公司；明胶，Sigma公司；人工重组基底膜材料、孔径8 μm滤膜，BD公司；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）鼠抗人单克隆一抗，Cell signaling公司。CO2保温箱，美国Forma scientific公司，型号31642/N；倒置显微镜，日本Olympus公司；凝胶成像分析系统，美国UVP公司，型号Imagestore7500。 　　2 实验方法 　　2.1 细胞培养与分组 　　选取MDA-MB-231细胞按1×105/孔的细胞数目接种于6孔板，分为5组，培养在含10%小牛血清的DMEM溶液中37 ℃、5%CO2温箱中培养。待细胞长满平板的80%～90%，加无血清DMEM溶液饥饿细胞12 h，将血通灵储备液用无血清DMEM分别稀释成5、10、20、30 μg/mL浓度的溶液给药。继续培养24 h。 　　2.2 细胞侵袭实验 　　将Transwell小室放置于24孔板中，将培养好的细胞以5×104/孔的细胞数目接种于Transwell小室的上室中，孵育培养至细胞贴壁。在上室加入血通灵药物剂量为（0、10、20、30 μg/mL）2 mL，下室中加入含10%小牛血清的DMEM培养液，孵育24 h。将反应后的Transwell从24孔板中取出，苏木红染色固定。血球计数板在倒置显微镜下观察3～5个视野，进行细胞计数，计算侵袭率[干预组染色细胞数÷空白对照组染色细胞数×100%]。 　　2.3 明胶酶谱实验 　　制备含0.1%明胶的10%Acry/Bis的分离胶，其上方加入5%浓缩胶。取上清液20 μL加入5 μL上样缓冲液混匀，置于4 ℃恒压180 V电泳75 min。电泳结束后，切去浓缩胶，将分离胶置于平皿中，加入2.5% Triton-X100 150 mL振荡反复清洗3次，每次20 min。将分离胶置于孵育缓冲液中，并置于37 ℃温箱孵育过夜。孵育完毕后倒出缓冲液，加入考马斯亮蓝染色30 min，至出现蓝背景下的清晰白色条带为止。凝胶成像分析系统成像目的条带。每组实验重复3次。 　　2.4 免疫印迹实验 　　应用细胞裂解液提取干预后的各组细胞的总蛋白，8%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，