丝氨酸蛋白酶Pic在迟缓爱德华氏菌侵染鱼类中作用.docVIP

丝氨酸蛋白酶Pic在迟缓爱德华氏菌侵染鱼类中的作用 　　摘要：本研究用染色体步移的方法从一株鱼类致病性迟缓爱德华氏菌TX01中克隆了丝氨酸蛋白酶的一个重要成员Pic基因，并利用缺失突变的方法构建了其基因突变株TXPic。通过比较突变株与野生株侵染大菱鲆及其外周血白细胞和头肾单核细胞的差异，发现TXPic的侵染能力较TX01有明显降低，这表明Pic可能作为毒力因子在迟缓爱德华氏菌侵染过程中发挥重要作用。 　　关键词：迟缓爱德华氏菌；丝氨酸蛋白酶Pic；毒力因子 　　中图分类号：S917.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0015-05 　　Abstract In this study， the full length of Pic gene， an important member of serine protease， was cloned from a pathogenic Edwardsiella tarda strain TX01 isolated from diseased fish by genome walking. The Pic-knockout strain TXPic was obtained by the means of in-frame deletion. By comparing the differences between TX01 and TXPic in regard to the ability of infecting turbot （Scophthalmus maximus） as well as its peripheral blood leukocytes and head kidney monocytes， it turned out that the virulence of TXPic was obviously impaired. The results indicated that Pic might be a virulence factor playing an important role in the infection of E. tarda. 　　Key wordsEdwardsiella tarda；Serine protease Pic； Virulence factor 　　迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是一种革兰氏阴性致病菌，其宿主范围广泛，包括鱼类、两栖类、爬行类、哺乳类以至人类等，可感染多种具有重要经济价值的鱼类，如牙鲆、大菱鲆、罗非鱼、鲶鱼、鲻鱼等[1～4]。被迟缓爱德华氏菌感染后的鱼会表现出多种症状，以牙鲆为例，病鱼会出现皮肤颜色变暗，腹部肿胀，直肠脱垂，肝、脾、肾形成脓疮等[1]。在水产养殖业中，迟缓爱德华氏菌可导致鱼类感染爱德华氏菌病，该病的大规模爆发会给水产养殖业带来严重的经济损失[2]。 　　迟缓爱德华氏菌利用多种毒力系统和毒力因子侵染并在宿主细胞中存活，这些毒力系统和因子包括Ⅲ型和Ⅵ型分泌系统、密度感应系统、黏附因子和胞外酶等[1，2，5]。Leung等[5]将迟缓爱德华氏菌侵染宿主的过程分成迁移、粘附、侵染、复制、胞内增殖、系统性感染等6个步骤。步骤1～4同时也是引发肠胃炎的过程：细菌侵染并在上皮细胞和胃肠组织中复制。迟缓爱德华氏菌是兼性胞内菌，能够在宿主细胞特别是在吞噬细胞内生存和复制，这使其能够逃避宿主免疫系统的杀伤。逃脱了宿主免疫系统的细菌大量复制，局部性感染上升为系统性感染。 　　致病微生物产生的许多蛋白酶在其致病过程中发挥了重要作用，例如，可参与降解宿主组织，影响免疫系统或作为毒素发挥作用[6]。已有研究表明，丝氨酸蛋白酶中的一系列蛋白，包括Tsh、Pic、Pet、EspP等，在致病菌中是重要的毒力因子，具有凝集红血球、裂解粘膜蛋白、降解补体等活性[7～9]。 　　本研究从本实验室分离出的迟缓爱德华氏菌TX01菌株中克隆获得了丝氨酸蛋白酶Pic基因，并利用缺失突变获得了其基因突变株TXPic，通过比较TXPic与TX01在侵染大菱鲆个体、外周血白细胞（peripheral blood leukocytes， PBL）和头肾单核细胞能力上的差异，分析Pic在TX01感染大菱鲆及其免疫细胞的过程中可能发挥的重要作用，以期促进对迟缓爱德华氏菌致病机制的了解。 　　1材料与方法 　　1.1菌株及培养条件 　　迟缓爱德华氏菌TX01菌株为本实验室分离所得[10]。大肠杆菌DH5α感受态购自天根公司。大肠杆菌S17-λpir 感受态购自 Biomedal （Sevilla， Spain）。大肠杆菌和迟缓爱德华氏菌分别于37℃和28℃在LB培养基中培养。抗生素