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二次回归正交旋转组合设计在梨子叶不定梢再生研究中的应用 　　摘要：以水晶×金二十世纪花后90 d的梨成熟胚子叶为外植体，利用二次回归正交旋转组合设计对其再生体系研究中的关键因素6-BA、NAA、AgNO3浓度建立数学模型，得到回归方程y=4.4053+0.8638X2-0.3869X2-0.0584X3-0.0157X1X2+0.0005X1X3+0.0112X2X3-0.6718X12-0.2192X22-0.7499X32。6-BA、NAA、AgNO3浓度在试验设定范围内对梨成熟胚子叶不定梢再生系数的影响均呈“低促高抑”现象；且培养基中6-BA、NAA、AgNO3的浓度分别在5.955-7.124mg?L-1、0.281-0.473mg?L-1和2.199～2.801mg?L-1，梨成熟胚子叶不定梢再生系数大于3的可靠性为95％。 　　关键词：梨；子叶；二次回归正交旋转组合设计；再生体系；数学模型 　　中图分类号：$661.2　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)01-171-05 　　 　　二次回归正交设计是回归分析与正交设计的有机结合，以具有试验次数少，数据处理简便，可进行优化分析等优点，已在微型月季、爆仗竹、香石竹等植物组织培养研究中得到广泛应用。但二次回归正交设计的不足之处在于：试验因素空间各试验点与中心点距离不同，即回归方程预测值的变异程度不同，因而难以根据试验结果直接选择最佳控制区域。而二次回归正交旋转组合设计是在二次回归正交设计的基础上，使分布在同一个球面上的试验点的回归估计值具有相同的方差，从而可直接依据数学模型计算各因素与指标之间的数学关系，实现因素之间及因素与指标之间的定量分析。但二次回归正交旋转组合设计在植物组织培养研究中很少应用。 　　6-BA及NAA促进梨成熟胚子叶不定梢再生的研究已见报道，但仅局限于浓度组合优化，并没有建立相应的数学模型。AgNO3作为乙烯合成酶ACC的一种抑制剂，能抑制乙烯的生物合成，已日益成为植物子叶再生研究中不可或缺的一类外源添加剂。据报道，在一定浓度范围内AgNO3对梨子叶不定梢再生的促进作用可提高15％左右。我们拟将AgNO3作为促进梨成熟胚子叶再生的重要因素之一，基于6-BA、NAA及AgNO3浓度进行三因素二次回归正交旋转组合设计，通过建立数学模型进行预测预报，为梨成熟胚子叶不定梢再生研究提供规范化的数学方法。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　取材和培养条件 　　供试材料以四川农业大学梨种质资源圃中水晶×金二十世纪花后90d的成熟胚子叶为外植体。无菌条件下剥开种子，取出成熟胚。将子叶从胚轴上剥离，横切为近、远轴两部分，远轴面接触培养基，接种于附加不同浓度6-BA、NAA和AgNO3的NN69培养基上(表1)。暗处理21d后，在温度(25±1)℃，光照48001X，光周期(光照／黑暗)16h/8h条件下继续培养。每隔28d继代1次。 　　 　　1.2　二次回归正交旋转组合设计试验方案的拟定方法 　　1.2.1　二次回归多项式方程的确立　试验对6-BA浓度、NAA浓度及AgNO3浓度3个因素进行筛选，因此建立三元二次回归方程Y=B0+B1X1+B2X2+B3X3+B12X1X2+B13X1X3+B23X2X3+B11X12+B22X22+B33X32(B0为常数项；B1、B2、B3为一次项回归系数；B12、B13、B23为交互项回归系数；B11、B22、B33分别为6-BA浓度、NAA浓度及AgNO3浓度的二次方效应回归系数)。 　　1.2.2　试验各因素5水平及编码值的确立根据本实验室前期研究，确定6-BA为0-9mg?L-1，NAA为0-1mg?L-1，AgNO3为0-5mg?L-1在此范围内，根据二次回归正交旋转组合设计，6-BA、NAA和AgNO3浓度分别取5个水平，编码值记为-r，-1，0，1，r，各因素变化区间记为△i，在零水平试验组合设置9次 　　 　　 　　 　　1.2.3　试验方案的确定选用三因素二次回归正交旋转组合设计表(表2)。把6-BA浓度、NAA浓度、AgNO3浓度编码值分别安排在所选的设计表有关列上，表内的处理组合号即为试验号。为估算回归方程中的常数项B0，在设计表的最前面添上一编码值全为“1”的X0列。在设计表的各因素X1、X2、X3列下面均添加r和-r行。交互列X1X2、X1X3、X2X3的编码值分别为x1与x2、x1与x3、X2与X3之乘积。为了避免直接平方后使组合设计的正交性受到破坏，对二次项列X12和X22及X32的编码值进行中心化处理，以中心编码值Xj2代替平方项编码值。 　　中心化处理公式：Xj2=Xj-1／N∑Xj2其中Xj为正交旋转组合设计中各因素不