乙肝宁颗粒抗乙型肝炎病毒体外实验研究.docVIP

乙肝宁颗粒抗乙型肝炎病毒的体外实验研究 　　摘要：目的 探讨体外乙肝宁颗粒抗乙肝病毒活性。方法 将不同浓度乙肝宁颗粒与HepG⒉⒉15细胞株共培养9d，以拉米夫定为阳性对照药，以MTT比色法观察药物细胞毒性；用ELIS法测定细胞上清液中乙型肝炎病毒e抗原（ HBeAg），乙型肝炎病毒s抗原（ HBsAg）；采用荧光定量PCR法（FQ-PCR） 测定细胞上清液HBV DNA，计算抑制率。结果 乙肝宁颗粒在体外能有效抑制HepG⒉⒉15细胞分泌HBsAg和HBeAg，最大抑制率分别为54.69%和25.93%；对HBV DNA的复制有一定抑制作用（P0.05）。结论 乙肝宁颗粒能有效抑制HepG⒉⒉15细胞中HBV复制，说明在体外具有显著的抗乙型肝炎病毒作用，且毒性较小，具有良好应用前景。 　　关键词：乙肝宁颗粒；HepG⒉⒉15细胞；乙型肝炎病毒 　　乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。中医药是我国的特色和宝库，在治疗病毒性肝炎方面发现了不少有效的单方和复方制剂。 　　乙肝宁颗粒是基于理论研究和临床观察，将黄芪、党参、白花蛇舌草、绵茵陈等13味中药按君、臣、佐、使进行配伍而制成的复方颗粒剂。具有补气健脾，活血化瘀，清热解毒的功效，用于慢性乙型肝炎[1]。文献报道[2-8]临床上应用乙肝宁颗粒治疗慢性乙肝疗效较好。伍一文[9]等对其保肝、降酶、抗鸭乙肝病毒及免疫功能等作用进行了实验研究。为探讨乙肝宁颗粒抗乙肝病毒作用，本文用HepG⒉⒉15细胞株为模型，考察了用药后细胞培养上清液中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、E抗原（HBeAg）的改变，并采用荧光定量PCR法考察其对HBV DNA的抑制效果，评价其抗HBV活性。 　　1 材料 　　⒈1试药 HepG⒉⒉15细胞株 （购自上海细胞所），乙肝宁颗粒（九芝堂股份有限公司，购于东方大药房，批号130124），拉米夫定（3TC，葛兰素史克制药有限公司，批，HBeAg诊断试剂盒（批号201304035）和HBsAg诊断试剂盒（批号201307009）（上海华泰生物工程公司）、HBVDNA荧光定量PCR检测试剂盒 （批（上海科华生物工程股份有限公司）。四甲基偶氮唑盐（Sigma USA），MEM培养基粉、丙酮酸钠、胎牛血清（上海韵涵生物科技有限公司）、G418（Gibco，USA），Tryple express（Invitrogen，USA）， 　　⒈2仪器 荧光定量PCR仪（ABl7500，ABI，USA），CO2恒温培养箱（Thermo Fisher，USA），-80℃冰箱，酶标仪，倒置显微镜（德国Leica公司），生物安全柜（上海振梓创空气净化设备有限公司）。 　　2 方法 　　⒉1细胞模型[10] HepG⒉⒉15细胞株（购自上海细胞所），细胞用MEM培养液（含10%胎牛血清，500 mg?L-1G418），置37℃，5%CO2恒温培养箱中培养，隔3d换液，6d传代1次。待HBV DNA表达稳定后开始实验。 　　2.2乙肝宁颗粒溶液与3TC溶液的配制 将乙肝宁颗粒研细，准确称取乙肝宁颗粒粉末，3TC适量，溶解于无菌双蒸水中，按每次用量分装成若干份，保存于-20℃冰箱中，用时取出一份，用含2%胎牛血清，500mg?L-1 G418的培养基稀释制备成质量浓度分别为25mg?L-1，50mg?L-1，100mg?L-1，200mg?L-1，400mg?L-1的乙肝宁颗粒溶液，以及质量浓度分别为100mg?L-1，10mg?L-1，1mg?L-1，0.1 mg?L-1，0.01mg?L-13TC的溶液。 　　⒉3药物细胞毒性实验 参照Mosmann建立的四甲基偶氮唑盐法（MTT）[11]，检测药物对HepG⒉⒉15细胞生长的抑制作用。具体方法为HepG2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至3.0×106cells?mL-1。加入96孔培养板中，每孔100μL。培养板置于细胞培养箱中，37℃、5%CO2培养过夜待贴壁。吸去上清后分别加入乙肝宁颗粒供试品溶液和3TC溶液的DMEM培养基（含10%胎牛血清，pH 7.2），每孔100皿，每个浓度3复孔。同时设不加药物的细胞对照组。同条件下继续培养，每天收取上清液（-80℃冰箱保存）并更换原浓度新鲜药液，共加药培养9d。9d后，采用MTT法，测定570nm的吸光度（A），观察药物对细胞的毒性。实验重复3次，计算细胞存活率，按Reed-Meuench法[12]计算半数有毒浓度Tc50和最大无毒浓度TC0。TC50即细胞存活率为50%时的药物浓度；