中药复方多糖对鸡淋巴细胞免疫信号分子表达影响.docVIP

中药复方多糖对鸡淋巴细胞免疫信号分子表达的影响 　　摘要：探讨在体外环境下不同质量浓度中药复方多糖对鸡外周血淋巴细胞信号分子表达的影响。分别采用200、100、50、25、0 μg/mL 5个中药复方多糖质量浓度梯度在体外条件下刺激鸡外周血淋巴细胞，采用ELISA法测定中药多糖作用1、2、4 h时细胞内环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）的含量，以及作用24 h时钙离子（Ca2+）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（iNOS）的分泌水平。结果表明，与对照组相比，试验组能显著提高细胞培养上清中cAMP、cGMP的水平（P0.05）。中药复方多糖能显著提高淋巴细胞分泌iNOS的水平（P0.05），而与其他多糖组相比，100 μg/mL 多糖组淋巴细胞分泌iNOS的水平显著提高（P0.05）。中药复方多糖可通过改变Ca2+、cAMP、cGMP、NO、iNOS等细胞内信号分子的活性或含量而启动细胞信号传导，从而调节细胞的活性和功能，促进相关基因的表达和释放，发挥免疫调节作用。 　　关键词：中药复方；多糖；黄麻鸡；淋巴细胞；免疫信号分子 　　中图分类号： S852.4文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）05-0167-03 　　中草药具有安全、低毒、低残留、不易产生抗药性等优点，被广泛研究并运用到畜禽生产中以有效增强畜禽机体抵抗病原的能力。研究发现，中草药中提取的多糖是能够调节畜禽免疫力的主要物质之一[1]。单一活性多糖是近年来中药免疫药理学研究的热点，却鲜见关于中药复方多糖的研究。目前，中药多糖免疫调节作用的机制尚未明确。已有研究发现，中药多糖通过与免疫细胞表面受体结合，改变环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、钙离子（Ca2+）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（iNOS）等免疫细胞内信号分子的活性或含量而启动细胞信号传导，调节细胞的活性和功能，促进相关基因的表达和释放，发挥免疫调节作用[2-3]。 　　朱晓庆等研究发现，中药复方免疫增强剂能在一定质量浓度范围内增强鸡的免疫调节作用[4]。本试验以鸡外周血淋巴细胞?檠芯慷韵螅?在体外条件下研究一定纯度中药复方多糖对淋巴细胞中环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、钙离子（Ca2+）、一氧化氮（NO）、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）等信号分子产生的影响，为进一步揭示中药复方多糖的作用机制提供依据。 　　1材料与方法 　　[HTK]1.1试验药物[HT] 　　中药复方多糖是由笔者所在实验室自主开发的中药复方免疫增强剂，经水提-醇沉法提取后，由AB-8大孔吸附树脂吸附解吸附后获得精制中药多糖，经苯酚-硫酸法测定中药多糖含量为79.6%。采用灭菌蒸馏水将其配制成 200 μg/mL 的中药复方多糖母液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，于4 ℃下储存备用。 　　1.2试剂与仪器 　　葡萄糖标准品、苯酚、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙醇、丙酮、石油醚、浓硫酸均为AR级。鸡外周血淋巴细胞分离液（TBD，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司），PBS磷酸缓冲液（Hy Clone，赛默飞世而生物化学制品北京有限公司），胎牛血清（Gibco公司），RPMI1640培养基（Hy Clone），双抗（Gibco公司）。鸡cAMP、cGMP、Ca2+、NO、iNOSELISA检测试剂盒均购自上海蓝基生物科技有限公司。 　　生物安全柜（Thermo公司），CO2培养箱（Thermo公司），垂直离心机（Thermo公司），OLYMPUS倒置相差显微镜，Power Wave XS2 BioTek型酶标仪。 　　1.3试验动物 　　40羽新疆黄麻鸡购自石河子市孵化场，按照试验动物饲养方法饲养至体质量达1.5～2.0 kg。 　　1.4试验方法 　　1.4.1鸡外周血淋巴细胞的分离与培养 　　采用含EDTA的无菌采血管在鸡翅下静脉采集2 mL血液，将血液用等体积PBS液稀释混匀，将稀释的4 mL血液缓慢加入4 mL淋巴细胞分离液层上，采用Ficoll密度梯度离心法（22 ℃，800 g，垂直离心30 min），收集中间层白色云雾状的外周血单核细胞（PBMC）。得到的细胞经5倍体积的PBS（4 ℃）洗涤2次（2 500 r/min，离心10 min），最后采用完全RPMI1640培养液洗涤1次（2 500 r/min，离心10 min）。将细胞重悬在1 mL含15%胎牛血清的完全RPMI1640培养液中，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养2 h，除去贴壁细胞，收集悬浮细胞。采用PBS缓冲液洗涤细胞2次（1 500 r/min，离心10 min），再用完全RPMI1640培养基重悬悬浮细胞，经台盼蓝染色，细胞存活率大于95%，采用细胞计