乳宁合剂对乳腺癌小鼠癌组织VEGF及MVD表达影响研究.docVIP

乳宁合剂对乳腺癌小鼠癌组织VEGF及MVD表达影响的研究 　　摘要：目的观察乳宁合剂对乳腺癌小鼠癌组织血管内皮生长因子（VEGF）表达和微血管密度（MVD）的影响。方法建立小鼠乳腺癌移植瘤模型，实验分为乳腺癌模型组、参一胶囊组、乳宁合剂高、中、低剂量组。分组给药21 d后，免疫组化法测定肿瘤组织中的VEGF和MVD。结果与模型组相比，乳宁合剂高、中剂量组及参一胶囊组均可明显降低VEGF和MVD表达（P0.05），其中以参一胶囊组作用最为明显，乳宁合剂高、中剂量组次之，并呈剂量效应关系。结论乳宁合剂可能通过抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤效应。 　　关键词：乳宁合剂；乳腺癌；血管内皮生长因子；微血管密度 　　中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）04-0085-02 　　三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中具有特殊生物?W行为和临床病理特征的一种独立类型，占乳腺癌总发病率的10～20.8%[1]。现有研究表明与非TNBC相比，TNBC具有侵袭性高、术后复发转移风险高、疾病进展快、内脏转移风险高等特点[2]，目前尚无明确针对TNBC的治疗标准。 　　全国第四、第五批老中医药专家学术经验继承工作指导老师、云南省名中医李斯文教授在三阴性乳腺癌的治疗中主张从肾论治，以补肾活血方药为主组成的乳宁合剂即为此而设。本实验通过建立小鼠三阴性乳腺癌模型，采用免疫组化法检测VEGF和MVD在肿瘤组织中的表达情况，探讨乳宁合剂抗三阴性乳腺癌的作用机理。 　　1材料 　　1.1实验动物与细胞系4～6周龄雌性BALB/c（nu/nu）小鼠，SPF级，体重18±2 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK（京）2007-0001，饲养于中国科学院昆明动物研究所实验动物中心。人TNBC细胞株MDA-MB-231购自中国科学院昆明动物研究所细胞培养中心。 　　1.2药物中药乳宁合剂主要由熟地、仙灵脾、菟丝子、枸杞子、丹参、郁金、莪术、八月札、薏苡仁、当归等组成。以上中药饮片均由云南省中医医院中药房提供，由本院制剂室制备，制剂方法：将中药浸泡2 h，常规煎煮3次，合并3次滤液，浓缩药液浓度相当于3.2 g/mL，4℃冰箱保存。参一胶囊（吉林亚泰制药股份有限公司，批号。 　　1.3试剂ZLI一9032浓缩型DAB试剂盒、兔抗鼠CD34单克隆抗体由北京中杉金桥生物技术有限公司生产，批号 　　1.4仪器电子天平JS1603-C：瑞士meittler公司；STPl20脱水机：MICROM公司；AF280―2包埋机：MICROM公司；HM335E切片机：MICROM公司；Nikon e.elipse 80i显微镜：Nikon公司；Carl Zeiss In--sing Systems：CarlZeiss公司；DRP-9052型电热恒温箱：上海森信实验仪器有限公司；BG-270隔水式电热恒温箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。 　　2方法 　　2.1乳腺癌小鼠模型制备、分组及给药在无菌条件下，取处于对数生长期的TNBC MDA-MB-231细胞，调整细胞密度为 1×107个/mL，以0.2 mL/只的量接种于BALB/C雌性小鼠左侧腋部皮下，待小鼠皮下实体瘤直径长至5 mm时随机分组给药。参一胶囊组用生理盐水配成5 mg/kg混悬液；乳宁合剂高、中、低剂量组分别以生理盐水配成32 g/kg，16 g/kg，8 g/kg的药液；以上各组均以10 mL/kg/只灌胃，每日1次；乳腺癌模型组每日给予等量生理盐水灌胃。以上各组连续给药3周。 　　2.2观察指标测定 　　2.2.1瘤重、抑瘤率检测持续灌胃21 d后次日处死小鼠，剥离瘤体，用电子天平称取各组小鼠实体瘤重量（W），计算抑瘤率（I）[3]：I=（对照组W―治疗组W）/对照组W×100%。 　　2.2.2小鼠瘤组织VEGF表达的测定瘤体取下后经10%甲醛固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，于肿瘤最大切面组织块处做3～5um的连续切片，进行免疫组化染色。切片置于60℃烤箱烘烤2 h；切片脱蜡至水；蒸馏水洗2 min；高压热修复：高压锅内放适量自来水，将修复液倒入烧杯内，将烧杯置于高压锅内煮沸，将切片放入装有修复液的烧杯内，加热至设定压力冒气后持续2 min，自来水冷却；3%H2O2溶液阻断过氧化物酶10 min；PBS洗5 min×3次；滴加一抗，37℃孵育60分钟；PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育60min；PBS洗5 min×3次；DAB显色；复染、透明封片，镜下观察。 　　2.2.3小鼠瘤组织MVD计算VEGF免疫组化法染色后，先在